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人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基

由Nexell技術(shù)團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化的人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，經(jīng)篩選配比的無(wú)血清添加物及其他輔助成分。該產(chǎn)品適用于人間質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清條件的培養(yǎng)；可維持人間質(zhì)干細(xì)胞良好的增殖速率，并保持良好的分化能力。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

1.使用Nexell的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞表型如何？

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原：CD19(0.35%)、CD34(1.23%)、CD45(1.08%)呈陰性表達(dá)；CD90(99.94%)、CD105(97.02%)呈陽(yáng)性表達(dá)。

2.通過(guò)臍帶組織貼塊法分離間充質(zhì)干細(xì)胞需要幾天？

7-10天，可見(jiàn)細(xì)胞爬出；第14天，細(xì)胞可傳代；之后，每2-3天細(xì)胞可傳代一次。

【產(chǎn)品用途與描述】

間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基可用于多種來(lái)源的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的原代細(xì)胞分離及細(xì)胞傳代培養(yǎng)，同時(shí)還能保持其多向分化的潛能，如人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-hMSC)、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AT-hMSC）、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCM-hMSC）等。

使用本產(chǎn)品無(wú)需添加血清或血清替代物。

間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確、無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源成分。產(chǎn)品批間差異小，非常適用于培養(yǎng)哺乳類干細(xì)胞，包括臍帶干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞等間充質(zhì)干細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，無(wú)病毒和支原體，性能穩(wěn)定，使用該培養(yǎng)基能使干細(xì)胞在理想營(yíng)養(yǎng)平衡狀態(tài)下進(jìn)行多代擴(kuò)增而不發(fā)生分化（10代以內(nèi)）。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1、可維持人類間充質(zhì)干細(xì)胞良好的增值速率；

2、保持良好的分化能力；

3、經(jīng)過(guò)微生物檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、霉菌及支原體）、PH檢測(cè)、滲透壓和內(nèi)毒素檢測(cè)；

4、不含任何動(dòng)物源的蛋白成分。

【產(chǎn)品規(guī)格與保存】

【產(chǎn)品穩(wěn)定性】

1、所有的產(chǎn)品都需要避光保存；

2、所有產(chǎn)品一旦超過(guò)標(biāo)簽注釋的有效期，必須放棄使用；

3、配制成培養(yǎng)基后，避光保存在2-8℃可存放3-4周；

4、為了更好的使用效果，請(qǐng)勿對(duì)試劑進(jìn)行反復(fù)凍融。

【產(chǎn)品主要成份】

間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的主要組成成分：氨基酸，維生素、無(wú)機(jī)鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素等。

【產(chǎn)品使用方法】

1、人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基準(zhǔn)備

將間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清生長(zhǎng)添加劑(MSCGs)在2-8℃過(guò)夜融化，按1:100比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即成為間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。

溫馨提示：間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基2-8℃避光條件下，可保存30天。若小量、多次使用，建議您將間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清生長(zhǎng)添加劑(MSCGs)分裝后，保存于-20℃冰箱，可避免培養(yǎng)基不必要的浪費(fèi)。

2、人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇（以T-75瓶為例）

①?gòu)谋渲腥〕雠囵B(yǎng)基，在生物安全柜或超凈臺(tái)中吸取適量（如T-75瓶：10-15mL)培養(yǎng)基沿上表面加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，切勿沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面，即：細(xì)胞生長(zhǎng)面。然后慢慢將細(xì)胞培養(yǎng)瓶平放，在37℃、恒溫CO2培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘后使用。

溫馨提示：請(qǐng)嚴(yán)格按照此步驟操作，否則可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)空白區(qū)域，即所謂的“生長(zhǎng)空洞"。多數(shù)用戶使用的不是專用的預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，而是普通的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，其表面環(huán)境并不利于無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境下的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。37℃放置5-10分鐘，可讓培養(yǎng)基中的促貼壁物質(zhì)更好地與細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部結(jié)合，使得間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁能力增強(qiáng)，降低“生長(zhǎng)空洞"出現(xiàn)的概率。

②從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細(xì)胞，迅速將凍存管放入37℃水浴中，快速融解。

溫馨提示：盡可能避免水沒(méi)過(guò)管帽，以減少污染的風(fēng)險(xiǎn)；要快速完成細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程（盡量控制在1分鐘內(nèi)），融化過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成復(fù)蘇后細(xì)胞活性較差。

③用70%-75%酒精消毒凍存管外壁，在生物安全柜或超凈臺(tái)中打開凍存管，用吸管/移液器將細(xì)胞凍存懸液緩慢移入裝有5-10mL細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中（在這一過(guò)程請(qǐng)盡可能避免產(chǎn)生氣泡）。

溫馨提示：為了減少細(xì)胞損失，往細(xì)胞凍存管中加入1mL培養(yǎng)基，稍微吹打，用吸管/移液器將這1mL的細(xì)胞懸液吸入離心管中，再用吸管/移液器將離心管中的細(xì)胞輕輕吹打混勻。

④1200rpm離心5min，棄上清，加入2mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按密度2×10⁴cells/cm²將細(xì)胞接種至步驟①中孵育完的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，添加細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶豎立，細(xì)胞懸液直接加到底部，切忌沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面。

⑤輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

⑥24h后，更換新鮮的培養(yǎng)基（溫育至37℃）。

3、人間充質(zhì)干細(xì)胞傳代（以T-75瓶為例）

①在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%，即可傳代。

溫馨提示：細(xì)胞融合度請(qǐng)勿超過(guò)90%。很多傳代后的細(xì)胞大比例死亡，是由于傳代前細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密（融合度過(guò)高），導(dǎo)致細(xì)胞消化異常（細(xì)胞整片或成片脫落），加之隨后的不當(dāng)操作（如用移液器反復(fù)吹打成片細(xì)胞使其成為單個(gè)細(xì)胞），此機(jī)械損失過(guò)程會(huì)嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞膜，引發(fā)大比例的細(xì)胞死亡；間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)凍存后再次使用時(shí)，尤為明顯。

②預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶，處理方法同細(xì)胞復(fù)蘇中的步驟①。

③在生物安全柜或超凈臺(tái)中，棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入5-10mL PBS清洗細(xì)胞后棄去，再加入2mL 0.05%胰酶-EDTA消化細(xì)胞。

④在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入5mL胰酶抑制劑終止消化。

⑤用移液器輕輕吹打瓶壁上還未脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞分散。

⑥將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1200rpm離心5min。棄上清，加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按細(xì)胞密度2×10⁴cells/cm²，將細(xì)胞接種至細(xì)胞傳代②步驟中孵育完的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，添加細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶豎立，細(xì)胞懸液直接加到底部，切忌沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面。

⑦輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4、人間充質(zhì)干細(xì)胞凍存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待凍存的細(xì)胞，加入胰酶抑制劑終止消化并離心，重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

②1200rpm離心5min，棄上清。

③根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無(wú)血清凍存液（無(wú)血清凍存液可即拿即用或置于冰袋備用），調(diào)整細(xì)胞密度在1×10⁶cells/mL左右。

④輕輕地重懸細(xì)胞，將重懸均勻的細(xì)胞按等份加入到滅菌的凍存管中（需提前做好標(biāo)記），旋緊凍存管蓋。

⑤迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃冰箱。

⑥過(guò)夜放置后，將細(xì)胞從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。