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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

派氏立克次體（Rickettsia parkeri）是一種原核生物，屬于立克次體科。它具有雙鏈 DNA 基因組，其基因組大小約為 1.3 至 1.4 Mb。它可以引起人類(lèi)疾病，如派氏斑點(diǎn)熱，臨床表現(xiàn)可能包括發(fā)熱、頭痛、皮疹等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致血管炎等并發(fā)癥。此外，它在狗中也有報(bào)道引起疾病，表明它對(duì)動(dòng)物健康也構(gòu)成威脅。因此快速檢測(cè)派氏立克次體具有重要的意義。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)派氏立克次體 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的

DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。定量檢測(cè)時(shí)線(xiàn)性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針?lè)?qPCR 反應(yīng)。

7.派氏立克次體探針?lè)晒釶CR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿(mǎn)足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液、超純水、派氏立克次體 qPCR 引物-探針干粉、派氏立克次體 陽(yáng)性對(duì)照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體

樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），

一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10 μL 上步所得第 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA-提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR

陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

派氏立克次體

qPCR 引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品稀釋液（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7 μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣

到 3 號(hào)管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠(chǎng)家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效， 不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠(chǎng)家聯(lián)系。

13.如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須沒(méi)有讀數(shù)， 或者大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct 值應(yīng)該小于 40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 沒(méi)有讀數(shù)、大于或等于 40 則均為陰性，如果小于40 則為陽(yáng)性。

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