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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

支原體屬（Mycoplasma spp.）是支原體目、支原體科的 1 屬，有近百個(gè)種。它們是一類沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過(guò)濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為 0.1～0.3 微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。支原體廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，大多不致病。但是它們常常污染培養(yǎng)細(xì)胞，污染發(fā)生率高達(dá)到 50%左右，故培養(yǎng)細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為一個(gè)世界性的難題。由于當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的 DNA、RNA 及蛋白表達(dá)發(fā)生改變， 而細(xì)胞的生長(zhǎng)率一般并未發(fā)生顯著的影響，故難以察覺(jué)，因此在早期快速診斷具有重要的意思。歐盟藥典已經(jīng)要求對(duì)使用培養(yǎng)細(xì)胞流程生產(chǎn)的生物工程制品進(jìn)行 9 種支原體的核酸檢測(cè)。為此本公司開(kāi)發(fā)了涵蓋歐盟所要求的 9 種支原體檢測(cè)試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)支原體通用 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.能檢測(cè)出至少 30 種最常見(jiàn)的支原體，其中包括歐盟所要求的 9 種，它們是萊氏無(wú)膽甾原體（Acholeplasma laidlawii）、發(fā)酵支原體（M.fermentans）、豬鼻支原體（M. hyorhinis）、口腔支原體（M. oral）、精氨-酸支原體（M. arginini）、肺炎支原體（M. pneumonia）、雞毒支原體（M. gallisepticum）、滑液支原體

（M. synoviae）和螺原體（Spiroplasma citri）。

6.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。

8.支原體通用探針?lè)晒釶CR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、支原體通用 qPCR 引物-探針干粉、支原體通用 qPCR 陽(yáng)性對(duì)照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 24 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本   試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣  品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），

一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品DNA-提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR 陰性

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

支原體通用 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)

樣到 3 號(hào)管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須無(wú) Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于40，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果無(wú) Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽(yáng)性。

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