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通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的CRISPR Cas13a轉(zhuǎn)染，高效檢測(cè)血漿外泌體中的miRNA
miRNA是一類由細(xì)胞的內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用。癌細(xì)胞獨(dú)特的胞內(nèi)環(huán)境可以通過miRNA等生物標(biāo)志物反映在其外泌體中。癌細(xì)胞來源的外泌體miRNA在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可以作為癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。然而，外泌體中miRNA的水平非常低。因此，以一種易于操作的方式識(shí)別、檢測(cè)和量化疾病相關(guān)外泌體miRNA仍然存在挑戰(zhàn)。
在上圖中的這項(xiàng)最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種新方法來檢測(cè)微量的癌癥相關(guān)的外泌體miRNA。該檢測(cè)方法基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有獨(dú)特的RNA酶活性，而且靈敏、可靠和有效。研究團(tuán)隊(duì)先設(shè)計(jì)了一個(gè)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)來切割熒光基團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記的報(bào)告分子，然后將其包裝到脂質(zhì)體中，這一脂質(zhì)體相當(dāng)于人造版外泌體，再使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜融合（MFS）策略，將CRISPR-Cas13a系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到外泌體中。由于Cas13a具有獨(dú)特的RNA酶（RNase）活性，RNA引導(dǎo)下Cas13a的反式切割活性可以裂解熒光團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記的報(bào)告細(xì)胞，導(dǎo)致靶標(biāo)RNA觸發(fā)RNA酶激活后熒光增強(qiáng)。當(dāng)脂質(zhì)體和外泌體融合在一起時(shí)，如果外泌體中存在靶標(biāo)miRNA序列，CRISPR-Cas13a就會(huì)識(shí)別并結(jié)合到靶標(biāo)miRNA，然后激活反式切割活性，有效切割并產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)。
上圖展示了乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）來源的外泌體與健康人乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）來源的外泌體以不同比例混合后，在ZetaView散射光檢測(cè)模式和熒光檢測(cè)模式下的檢測(cè)情況：
A圖：散射光模式下，盡管不同樣品的混合比例不同，但ZetaView能檢測(cè)的外泌體顆粒數(shù)量比較接近；熒光模式下，隨著含miR-21核酸的癌細(xì)胞外泌體比例降低，ZetaView檢測(cè)到的熒光顆粒明顯減少。
B圖：ZetaView散射光模式下測(cè)到的外泌體顆?？倽舛缺容^接近。
C圖：ZetaView熒光模式下測(cè)到的熒光顆粒濃度隨著癌細(xì)胞外泌體比例降低而明顯降低。
從該臨床樣本的熒光檢測(cè)結(jié)果來看，乳腺癌患者與健康捐贈(zèng)者的miR-21表達(dá)差異顯著。
研究團(tuán)隊(duì)表示，基于CRISPR-Cas13a的MFS-CRISPR平臺(tái)，可以直接用于檢測(cè)血液樣本，并成功區(qū)分來自乳腺癌患者和健康捐贈(zèng)者的臨床樣本。因此，通過MFS-CRISPR平臺(tái)檢測(cè)分析血液樣本，有望實(shí)現(xiàn)更快、更簡(jiǎn)便的癌癥診斷和監(jiān)測(cè)。
張俊利，師從張振中教授，于2021年12月入職于鄭州大學(xué)藥學(xué)院，直聘副研究員，主要研究方向?yàn)樯飿?biāo)志物分析。相關(guān)研究成果以作者或通訊作者在Journal of Extracellular Vesicles（2020，IF：25.841）、ACS Sensors（2023, IF：9.618）、Analytical Chemistry（2023, IF：8.008）、ACS Applied Materials & Interfaces（2020, IF：9.229）、Nanoscale（2022, IF：8.307）、Sensors and Actuators B:Chemical（2018, IF：6.393）和ACS Biomaterials Science & Engineering（2021, IF：5.395）等期刊上發(fā)表SCI論文7篇，授權(quán)國家發(fā)明專利1項(xiàng)。
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