每1 ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩管體，室溫靜置 5min。4°C下12,000 ×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無(wú)色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

3、RNA沉淀

將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入1 ml TRIZOL試劑的此時(shí)加0.5 ml的異丙醇。混勻后15到30°C孵育10分鐘后，于4°C 12,000 ×g離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

4、RNA清洗

移去上清液，每1 ml TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4°C 7,500 ×g離心5分鐘。

5、重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5 - 10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要*干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A_{260 / 280}比值將小于1.6。溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60°C孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于- 70°C。

二． RNA濃度與純度測(cè)定

取1μlRNA樣品稀釋100倍后測(cè)定RNA濃度及OD260、OD280。純的RNAOD260/280在1.8～2.0之間。樣品RNA濃度計(jì)算公式為：A260 X 稀釋倍數(shù)×40 ng/ul。

三． RT（PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real Time，Takara）

1、按下列組份配制RT反應(yīng)液

5×PrimeScript Buffer	2 μl
PrimeScript® RT Enzyme Mix I	0.5μl
Oligo dT Primer（50 μM）*1	0.5μl
Random 6 mers（100 μM）*1	0.5μl
Total RNA	0.5ng
RNase Free dH2O	Up to 10μl

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min，85℃ 5 sec。

3、反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。

四． qPCR（SYBR Premix Ex Taq，Takara）

1、按下列組份分別配制Realtime PCR反應(yīng)體系。

SYBR Premix Ex Taq	12.5 μl
PCR Forward Primer（10 μM）	0.5 μl
PCR Reverse Primer（10 μM	0.5 μl
DNA模板	1.0 μl
dH2O（滅菌蒸餾水	10.5 μl
Total	25μl

輕彈管底將溶液混合，5000 rpm短暫離心。

2、步驟1配置的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

95℃，5min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；79℃，20秒（收集熒光））。

為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，（95℃，2min；60℃，20秒；72℃，20秒；99℃，15秒，并從72℃緩慢加熱到99℃（8分鐘）。

3、結(jié)果與計(jì)算

各樣品的目的mRNA和內(nèi)參（GAPDH）分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2 ^-^△△^CT法進(jìn)行分析

乾思生物整理編輯：進(jìn)口elisa試劑盒，國(guó)產(chǎn)elisa試劑盒，elisa試劑盒，試劑盒，dna提取試劑盒，免疫組化試劑盒，rna提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，dna試劑盒

欧美……一区二区三区,欧美日韩亚洲另类视频,亚洲国产欧美日韩中字,日本一区二区三区dvd视频在线

Real-time PCR技術(shù)

會(huì)員登錄

收藏該商鋪

提示