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免疫組化非特異性染色及控制方法

來源:武漢基因美生物科技有限公司   2011年03月02日 11:54  

                                                          免疫組化非特異性染色及控制方法

一、非特異性染色的識別

常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性,均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽性反應(yīng)產(chǎn)物點、團(tuán)或塊狀。

二、非特異性染色的原因

1. Ig與Fc受體結(jié)合

多見于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,組織細(xì)胞表面多),主要是和二抗反應(yīng),因為一抗一般稀釋度均較大,因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見。

避免方法

(1)用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;

(2)用不含F(xiàn)c段的抗體,但價格貴。(V區(qū),C1區(qū)不含F(xiàn)c段,用Pepsin消化)

2. 靜電吸附

抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結(jié)合,如膠原纖維。

避免方法

(1)盡量稀釋一抗;

(2)降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;

(3)用去垢劑如triton-100,Tween-20等處理切片。

3. 二抗與組織中的Ig結(jié)合

如羊抗兔的二抗,二抗可以標(biāo)本中(人)Ig發(fā)生交叉反應(yīng),科學(xué)上越接近的動物,交叉反應(yīng)越明顯,如人與猴,兔與豚鼠。

避免方法:用與待測組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。

4. 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合

如醛類固定后未能*的沖洗,殘留醛基可以和Ig結(jié)合。

避免方法

(1)*沖洗;

(2)0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗。

一、非特異性染色的識別
常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性,均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽性反應(yīng)產(chǎn)物點、團(tuán)或塊狀。
二、非特異性染色的原因
1. Ig與Fc受體結(jié)合
多見于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,組織細(xì)胞表面多),主要是和二抗反應(yīng),因為一抗一般稀釋度均較大,因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見。
避免方法:
(1)用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;
(2)用不含F(xiàn)c段的抗體,但價格貴。(V區(qū),C1區(qū)不含F(xiàn)c段,用Pepsin消化)
2. 靜電吸附
抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結(jié)合,如膠原纖維。
避免方法:
(1)盡量稀釋一抗;
(2)降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
(3)用去垢劑如triton-100,Tween-20等處理切片。
3. 二抗與組織中的Ig結(jié)合
羊抗兔的二抗,二抗可以標(biāo)本中(人)Ig發(fā)生交叉反應(yīng),科學(xué)上越接近的動物,交叉反應(yīng)越明顯,如人與猴,兔與豚鼠。
避免方法:用與待測組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。
4. 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合
如醛類固定后未能*的沖洗,殘留醛基可以和Ig結(jié)合。
避免方法:
(1)*沖洗;
(2)0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗。
 
5. 內(nèi)源性過氧化物酶
紅細(xì)胞,粒細(xì)胞的含量尤其高,鏡下可以識別,不要將其當(dāng)成陽性結(jié)果。
避免方法:
(1)石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片;
(2)冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘(99:1)因為未經(jīng)固定包埋,大部分酶未被破壞;
(3)對于骨髓涂片 用非過氧化物酶標(biāo)記的抗體
6. 內(nèi)源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘。
7. 交叉反應(yīng)
PcAb敏感性高,但特異性稍低,容易出現(xiàn)非特異性染色。
避免方法:
(1)盡可能稀釋抗體;
(2)盡可能用McAb。
 
 

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