現(xiàn)代生物技術均通過細胞作為載體來進行，無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內(nèi)進行的。細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細胞用的物質，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。

隨著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的迅速發(fā)展，作為細胞培養(yǎng)領域中zui基本的原料－細胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學科和醫(yī)學研究的各個領域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。

*節(jié) 水與平衡鹽溶液

1、培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。用瓶貯存，存放時間一般不應超過2周。

2、緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。

第二節(jié) 細胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

一、營養(yǎng)成分 維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：

1、氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。

2、單糖：培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力zui高，半乳糖zui低。

體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。

3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，*。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

4、無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

二、促生長因子及激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如H-化-可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。

三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但zui大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。

五、無毒、無污染 體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到無化學物質污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。 

第三節(jié) 天然細胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養(yǎng)某些特殊細胞也是*。

一、血清(serum)細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質量又是關鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是的，所以血清是醫(yī)藥生物技術產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環(huán)節(jié)。

1、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質zui高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分zui少。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：

*:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；

第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制；

第三:不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。

3、血清主要作用：

提供基本營養(yǎng)物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。

提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（H-化-可-的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

4、細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：

對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。

血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。

取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。 

5、血清的質量標準:血清質量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查。

血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面：

理化性質：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

促生長效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養(yǎng)的細胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質量間的細微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結果與標準血清的測試結果比較。

對于使用者，判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質量，則應連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。

6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應有的作用。

使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，zui常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉化。 采購血清時，先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細胞培養(yǎng)中應用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細胞和原代細胞的培養(yǎng)。