第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無機(jī)鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

維生素：是維持細(xì)胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。

碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔@降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)*不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑，另一小部分通過*氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動(dòng)物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細(xì)胞生長而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細(xì)胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本-產(chǎn)品展示）

(2)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本-產(chǎn)品展示）

(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本-產(chǎn)品展示）

(4)199細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本-產(chǎn)品展示）

(5)水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基（參看本-產(chǎn)品展示）

(6)歐氏平衡鹽（參看本-產(chǎn)品展示）

(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本-產(chǎn)品展示）

(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基 

三、干粉培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基要注意以下問題：

認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。

配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。

液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時(shí)可制成無內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分?jǐn)嚢琛?/p>

通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時(shí)會(huì)上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

第五節(jié) 無血清技術(shù)及其培養(yǎng)基

經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開發(fā)了商業(yè)化的多種無血清培養(yǎng)基，可滿足眾多廠商的需求。

一、無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。 

添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：

(1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

(2）促生長因子及激素：針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞*的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。zui常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是zui常見的。

二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：

處于對數(shù)生長中期

>90% 活細(xì)胞率

適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基（SFM）:

1、直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2、連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時(shí)，以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會(huì)發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。 

三、使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

增加確定性

性能更加一致

容易進(jìn)行純化和下游加工

細(xì)胞功能的評估

增強(qiáng)生長和/或產(chǎn)量

生理反應(yīng)性的較好對照

增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測

第六節(jié) 無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一、無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)zui終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，zui終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。

二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液:取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的*pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的*pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。 

三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1、NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時(shí)應(yīng)加溫30℃，*溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于－20℃。使用時(shí)，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解；需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨zui少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是*替代物，它無需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。