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炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2019年03月25日 09:02  

通用名稱:炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測,對引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,在反應體系中含基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒【主要組成成份】

序號

組成

25T/盒

50T/盒

1

 RT-PCR反應液

375 μL×1管

750 μL×1管

2

逆轉(zhuǎn)錄酶

 50 μL×1管

100 μL×1管

3

 Taq酶

 75 μL×1管

150 μL×1管

4

陽性對照

 40 μL×1管

 40 μL×1管

5

陰性對照

 40 μL×1管

 40 μL×1管

6

說明書

1份

1份

注:陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,陽性對照為失去活性的cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-80以下,避免反復凍融。

炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當次實驗所需要的反應數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

 2.0 μL

Taq酶

 3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備(樣本處理區(qū))

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒

反應體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集熒光信號

PCR

反應

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

    42℃:10分鐘(min)

1

預變性

95℃:3分鐘(min)

1

預擴增

95℃:5秒(s)

5

55℃:40秒(s)

PCR擴增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 (1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 (2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定:

(1)陽性:標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

(2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

(3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+)

標本中檢出RNA

陰性(-)

標本中未檢出RNA

【檢驗方法的局限性】

  • 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
  • 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
  • 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

  • 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
  • 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。
  • 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
  • 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。
  • 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放。
  • 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
  • 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置;不同批號試劑不能混用。
  • ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
  • 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

炭疽桿菌實時熒光RT-PCR試劑盒

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