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非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2019年03月25日 09:05  

通用名稱:非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒

【包裝規(guī)格】  50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測,對引起的疾病診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒【主要組成成份】

序號

組成

25T/盒

50T/盒

1

 RT-PCR反應(yīng)液

375 μL×1管

750 μL×1管

2

逆轉(zhuǎn)錄酶

 50 μL×1管

100 μL×1管

3

 Taq酶

 75 μL×1管

150 μL×1管

4

陽性對照

 40 μL×1管

 40 μL×1管

5

陰性對照

 40 μL×1管

 40 μL×1管

6

說明書

1份

1份

注:陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,陽性對照為失去活性的cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒【樣本要求】

1. 適用標(biāo)本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標(biāo)本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒【檢驗方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應(yīng)液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

 2.0 μL

Taq酶

 3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

    42℃:10分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃:5秒(s)

5

55℃:40秒(s)

PCR擴(kuò)增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 (1)陽性對照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

 (2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+)

標(biāo)本中檢出RNA

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出RNA

【檢驗方法的局限性】

  • 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
  • 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
  • 樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

  • 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
  • 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機(jī)檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
  • 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
  • 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心。
  • 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨存放。
  • 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
  • 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。
  • ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
  • 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。

非洲豬瘟病毒實時熒光RT-PCR試劑盒

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