一、概述

1 當前細胞培養(yǎng)和觀察的常用方法

十九世紀起，當顯微鏡出現(xiàn)后，人們就開始嘗試對細胞結(jié)構(gòu)進行觀察，并在二十世紀發(fā)展出細胞的培養(yǎng)技術。單層細胞的培養(yǎng)相對方便，而且商業(yè)化的顯微鏡非常適合于平面的、薄樣品的觀察，所以，在二十世紀的中后期，人們普遍采用 2D 的細胞培養(yǎng)方法，進行生物學的研究，以及進行藥物的篩選、開發(fā)和疾病治療的研究。

2 2D 和 3D 細胞培養(yǎng)及對細胞的影響

通常，2D 細胞培養(yǎng)不但被用來在體外研究不同類型的細胞，還被用來進行藥物的篩選和評價等各個方面。這種單層的培養(yǎng)體系使細胞生長于聚酯或玻璃的表面，同時存在的培養(yǎng)液能夠給細胞生長提供養(yǎng)分。無數(shù)的生物學家通過這種方式極大地推動了生物學和醫(yī)學進展。

然而，其簡單的操作方法也造成了這種模式無法準確的描述和模擬細胞在體內(nèi)復雜的微環(huán)境和各種復雜生物學過程，如細胞信號傳遞，生化過程或幾何學改變。另外通過 2D 細胞培養(yǎng)方法獲得的數(shù)據(jù)應用于體內(nèi)也會造成一些誤導和不可預測性。這些原因促使很多科學家將目標轉(zhuǎn)向了 3D 細胞培養(yǎng)技術，一種在體外能夠更加準確描述細胞真實微環(huán)境的方法。細胞在體外三維環(huán)境下生長產(chǎn)生特殊的生物物理和生物力學信號，這些都會影響到細胞的功能，如細胞遷移、細胞粘附、增殖和基因表達等 ( 如下圖 )。

我們知道，有多種不同的 3D 細胞培養(yǎng)方法，不同的方法有著各自的優(yōu)點和缺點。與 2D 培養(yǎng)不同，3D 細胞培養(yǎng)具有微小結(jié)構(gòu)的形成和復雜的環(huán)境特征，能夠促進細胞的分化和組織形成。實際上，相比較于生長于 2D 環(huán)境，在 3D 環(huán)境中細胞能夠承受更多的形態(tài)學和生理學變化。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞基底的成分和結(jié)構(gòu)不但能夠影響基因表達，還能增強細胞間聯(lián)系。如有些促進細胞增值的基因在 3D 培養(yǎng)環(huán)境下受到抑制，從而不會像 2D 培養(yǎng)下那樣無限生長。3D 細胞培養(yǎng)還會促進共培養(yǎng)環(huán)境下的兩種不同細胞群體的生長，從而能夠準確重現(xiàn)組織功能。另外，3D 培養(yǎng)技術能夠使細胞微環(huán)境參數(shù) ( 溫度、化合物濃度、氧氣、pH 等 ) 易于控制和監(jiān)測。

但是 3D 細胞培養(yǎng)技術也有明顯的缺陷，這些缺陷還需要技術進步來彌補。首先，一些基質(zhì)膠會從動物或其他來源吸收一些有害或不需要的物質(zhì)，如病毒，可溶性因子等，會干擾細胞培養(yǎng)。有些基質(zhì)具有很好的細胞粘附性，使細胞去除過程更加困難。 另外，3D 細胞培養(yǎng)技術是一種高性價比的技術，能夠在藥物評價階段省掉動物藥物測試過程，整個流程可實現(xiàn)自動化，可重復性好。

3 3D 細胞技術的延伸和前景

隨著 3D 細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展和成熟，大量的新的相關技術出現(xiàn)，如微流控技術、微器官技術等。這些技術使得培養(yǎng)環(huán)境的控制和監(jiān)測更加容易，同時能夠使藥物推進臨床的速度大大加快，評價結(jié)果的可靠性也會大大增加。

二、3D 細胞球培養(yǎng)方法

根據(jù) 3D 細胞培養(yǎng)中細胞生長情況，分為兩種方法，基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養(yǎng)法和無基質(zhì)(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養(yǎng)。

1 基質(zhì)的類型

基質(zhì)是3D細胞培養(yǎng)的重要成分，根據(jù)不同的培養(yǎng)條件和目的，選擇不同的基質(zhì)。

2 基于 Scaffold 基質(zhì)膠的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 細胞培養(yǎng)法

基質(zhì)為細胞培養(yǎng)中的細胞提供支撐。細胞能夠增殖并遷移進入基質(zhì)網(wǎng)絡內(nèi)部，終粘附到基質(zhì)上。當細胞生長時，成熟細胞相互影響，并終形成接近于細胞來源組織的微型結(jié)構(gòu)。在大部分情況下，這些細胞會表現(xiàn)為尺寸各異的球形，稱為細胞球：這些細胞結(jié)構(gòu)通常用于藥物篩選、評價或者其他 3D 細胞的應用。通常，有基質(zhì)支撐的 3D 細胞培養(yǎng)方法獲得的細胞球，由于基質(zhì)提供了較大的接觸面積，其大小會比沒有基質(zhì)支撐的方法獲得的細胞球更大。

2.1 基質(zhì)的種類和成分

根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型的不同，基質(zhì)蛋白纖維的特性和形狀應與之相配合。基質(zhì)蛋白纖維的布局應與模擬的器官結(jié)構(gòu)相符，具有類似的結(jié)構(gòu)、尺度和功能。然而，基質(zhì)纖維越大、結(jié)構(gòu)越復雜，就越難以提取。另外，為了防止任何可能出現(xiàn)的障礙 ( 免疫反應、纖維化、影響生長 )，無論采用何種類型的基質(zhì)，所采用的基質(zhì)都必須為細胞生長提供支撐，并具有生物相容性?；|(zhì)可以是水凝膠，薄膜 ( 或者管狀 )，和 3D 基質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.2 水凝膠基質(zhì)

凝膠具有很好的力學特征，是常用的基質(zhì)。它具有類似于組織的剛性，在某種程度上能夠很好地模擬細胞外基質(zhì)的作用。事實上，就像其他的基質(zhì)，凝膠這種空洞結(jié)構(gòu)就像一個能夠保持營養(yǎng)物質(zhì)和可溶性因子 ( 如細胞因子、生長因子 ) 的細胞外基質(zhì)，這些可溶性因子由細胞產(chǎn)生，在凝膠種擴散，使細胞通過非直接接觸的方式進行通訊聯(lián)系。通過這種方法，非常適合于進行微型細胞實體組織的模擬，并在此基礎上進行藥物的毒性檢測和評價等。

包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸鹽、明膠、透明質(zhì)酸、瓊脂糖、層粘連蛋白、纖維蛋白 ) 都可作為基質(zhì)。但是其凝膠化基質(zhì)比較復雜，會使制備和操作非常困難。

合成的和天然的生物聚合物也可作為 3D 培養(yǎng)的凝膠。根據(jù)實驗條件和終目的，可找到多種不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更適合于構(gòu)建基質(zhì)。

其他類型基質(zhì)：除了水凝膠外，還有很多基質(zhì)材料可用。非凝膠聚合材料基質(zhì)常用于組織工程，不同的材料都需要符合所要模擬器官的機械和物理學特征。

3 無基質(zhì) (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 細胞培養(yǎng)

要形成細胞球，細胞團塊即可作為一種很好的生理模塊而無需依賴于固體物質(zhì)的支持。這樣獲得的細胞球通常比較小，也相對松散。主要的 scaffold-free 3D 細胞培養(yǎng)法就是 forced-floating ( 強制浮動法 ), hanging drop ( 懸滴法 ) 和 agitation based( 攪動法 )。

forced-floating ( 強制浮動法 ) 是用*低粘附的聚合物包被的多孔板來進行。通過向孔內(nèi)加入細胞懸液后進行離心獲得。

懸滴法是通過將含有細胞的液滴處理，使細胞聚集為緊湊的均一的細胞球。

agitation based ( 攪動法 ) 使用生物反應器獲得三維的細胞球結(jié)構(gòu)。