四大因素，從源頭解析Duplication

導語：

測序技術面世至今發(fā)生了諸多的技術革新，經(jīng)歷了sanger測序為代表的第—代測序、高通量為代表的第二代測序和單分子實時測序為代表的第三代測序。迄今為止，高通量測序（ next generation sequencing NGS）技術日趨成熟，正式進入臨床疾病診療階段，與我們生活息息相關。

Dup背景解讀

高通量測序檢驗流程可分為“實驗室操作”（又稱為“濕實驗”）和“生物信息學分析”（又稱“干實驗”）兩部分。對應的實驗操作部分，可點擊高通量建庫了解。生物信息學主要是測序完成之后的數(shù)據(jù)分析和解讀，包括數(shù)據(jù)的拆分、比對和匯總，其中數(shù)據(jù)的有效性，也就是報告中常見的duplication rate 這一名詞，是生信分析的一個重要指標，它讓我們對測序得出的數(shù)據(jù)進行一個大致的了解。

所謂Dup，即重復序列Duplicate reads（涉及相關概念可點擊此處），這些重復序列在總測序序列中占比簡稱為Dup rate。由于這些重復序列不能帶來額外信息，相反會影響變異檢測結(jié)果準確性，因此下游生信分析中這些重復序列是需要去除的去掉，這也就意味著Dup rate越高，數(shù)據(jù)利用率越低，測序成本浪費的也就越多。因此在NGS生信分析中首要了解的就是dup rate的占比

常見測序?qū)狣up可能值

影響Duplication Rate的因素

高通量測序技術的不斷革新，生物信息學的分析也不斷進步與發(fā)展，就dup來源，根據(jù)其定義與現(xiàn)實的案列分析，客觀來講主要有以下幾個方面：

1.樣本本身所導致的dup值

2.建庫過程中產(chǎn)生的dup值（片段化，接頭連接，PCR擴增）

3. Cluster生成對dup的影響（主要指上機之后）

4. 光學分辨引起的dup

通常來講，我們認為的dup都是些無效數(shù)據(jù)，且基本上都是從建庫過程中產(chǎn)生的，但實際案列告訴我們，有些時候dup也是“好”的有用數(shù)據(jù)，上機過程導致的dup值可能要要比我們建庫過程中產(chǎn)生的dup值要大的多。

影響因素解讀：

1樣本本身所導致的dup值

不同物種的基因含量不同，基因多樣性不同，對應的基因表達情況也千差萬別。在*相同操作的前提下，不同的樣本對應的dup值也有所差別。比如

1）cfDNA和ctDNA：游離DNA斷裂不是隨機的而是有偏向性的，自然cfDNA的分子多樣性可能會比人工cfDNA要差一些，且片段長度一般分布在165bp左右，較為集中的size分布比物理打斷的size分布更不容易丟失片段，這樣可能導致相比較常規(guī)的基因組樣本cfDNA和ctDNA引起Duplication Rate會高一些。

2）基因組DNA ：以人類基因組為列，本身含有大量的基因組信息，不同細胞相同編號染色體在基因組片段化過程中是有可能產(chǎn)生一些起始位置和終止位置相同的分子片段的。此時對應的dup值就是樣本本身的dup值。在后期分析中可以作為保留數(shù)據(jù)進行分析。

3）甲基化DNA：經(jīng)過亞硫酸氫鹽反轉(zhuǎn)的DNA，堿基類型都少了一種，分子多樣性不但下降，更是引入了尿嘧啶，外加一些建庫方式有著明顯的GC偏好性，導致后期對應的dup值會明顯的變高。

4）RNA：一般我們所做的測序都是全外顯子組，只占全基因組的2%不到，少了內(nèi)含子以及非基因區(qū)域的參與，同時對應有高表達的基因和不表達的基因，分子多樣性肯定就弱了很多。后期對應的dup值是目前測序中占比量較高的樣本。

2.建庫過程中產(chǎn)生的dup值

1）片段化對Duplication Rate的影響

無論是超聲波打斷、高壓氣體噴斷，還是酶切切斷，都要注意隨機性和均一性，同時需要保證片段化之后獲得適當?shù)拈L度，片段長度越小，導致擴增越容易，加劇了PCR bias，后引起PCR產(chǎn)物復雜度降低，dup rate升高。

2）鏈接效率對Duplication Rate的影響

對末端修復連接的效率的考量應該根據(jù)樣本類型來考慮，比如ctDNA，單細胞樣本，對應的連接效率就要很高，不然低頻的目標片段就會消失。某種程度上，連接效率越高，分子多樣性越好，dup rate也就越低。

3）PCR擴增對Duplication Rate的影響

首先我們了解一下PCR bias：

PCR擴增帶有一定的偏好性和錯配率，會影響終形成文庫的覆蓋度和測序準確性。

PCR本身對于不同GC含量的樣本的擴增效率是不同的，中等GC含量擴增效率///高，高GC含量擴增慢，也就是說PCR循環(huán)越多，擴增困難和擴增容易的片段之間相差就會越大，對應的分子多樣性就會越低，dup就會增大。

另外PCR本身在擴增的過程中可能會產(chǎn)生一些堿基的錯配，錯誤的擴增可能會到出現(xiàn)與現(xiàn)有相同基因的結(jié)果，導致dup值升高。

另外我們解釋一下，為什么我們PCR擴增要控制在較小的循環(huán)數(shù)內(nèi)。

我們知道PCR過程中，每一次循環(huán)，對應生成的產(chǎn)物都是一樣的，PCR放大成百上千倍，為什么NGS的Dup rate只有十位數(shù)甚至是個位數(shù)呢？（對應的數(shù)學解釋可參考對應的參考文獻1）

舉例如下：

有編號1~1,000,000,000的1億個小球不同的DNA///片段），通過某種方法復制了一下（PCR擴增），然后每個編號的小球都變成了10個?，F(xiàn)在，你要從里邊挑選出1萬個小球出來（測序數(shù)據(jù)量），挑選兩個一樣的概率會有多大呢？也就是說雖然PCR將待測分子放大了成百上千倍，但是相對于數(shù)量遠遠多于納米孔/點數(shù)的Unique分子來說，能在茫茫人海中被1個孔隨機選中已是萬萬幸，更何況是再次隨機選中同一個Unique分子簇中的Copy形成Dup呢？

因此對于PCR過程中的dup值，我們可以人為的增加投入樣本的量（增加樣本DNA的多樣性），同時降低PCR的循環(huán)數(shù)，選擇均一性和保真性較好的擴增酶，就可以將這一過程中產(chǎn)生的dup，控制在合理的范圍內(nèi)。

3. Cluster生成對dup的影響

Cluster在flowcell上的生成也是一個PCR過程。這個PCR比較容易被人遺忘。如果cluster變少，影響dup rate。原因是比例少的分子可能不能產(chǎn)生cluster，唯—性分子數(shù)減少，進而影響dup rate。適當?shù)腸luster生成密度，不僅能夠獲得///佳的數(shù)據(jù)產(chǎn)量，也能夠獲得較低的dup rate。目前的平臺中，我們都希望cluster是單克隆(monoclonal)的，多克隆(Polyclonal)的cluster會出現(xiàn)空間距離過近而導致圖像識別時相互overlap的cluster被測序識別程序過濾掉，造成的直接影響就是cluster密度過高，數(shù)據(jù)產(chǎn)量降低，整張芯片的cluster多樣性降低，造成dup rate升高。

4. 光學分辨引起的dup

目前的測序平臺主要包括兩種擴增方式illumina和life的線性分子擴增，和ICG的滾環(huán)擴增，形成的DNA Nanoball都是靠流體來保證芯片表面利用率的，芯片利用率是數(shù)據(jù)高產(chǎn)出的基礎，相反待測分子與芯片的結(jié)合的同時，可能導致反應不充分的信號點因為信號強度顯著弱于反應充分的“鄰居”，從而被映射成兩個孔表達出一樣的信號，也就是一種光學上的Dup。

總結(jié)：

綜合考慮分析，影響dup的主要因素就是DNA的多樣性，其中樣本本身所產(chǎn)生或者增加的dup值，這種情況占比量較小，我們一般可以忽略；PCR產(chǎn)生的dup值，我們在選擇均一性和保真性較好的擴增酶的同時，人為的降到底拷貝數(shù)也是可行的（一般控制在6-10 cycle）；至于Cluster和光學分辨引起的dup，主要是和測序平臺相關，不同測序平臺還是有一定的差異的，主要原因是cluster與光學分辨過程中導致的DNA多樣性的改變和信號收集的誤差，目前來說可能是產(chǎn)生dup的主要來源。

【1】Eric Vallabh Minikel. How PCR duplicates arise in next-generation sequencing[Z].2012,12.

【2】illumina. Effects of Patterned and Nonpatterned Flow Cells [Z]. 

【3】 Sayols S, Scherzinger D, Klein H. dupRadar: a Bioconductor package for the assessment of PCR artifacts in RNA-Seq data. BMC Bioinformatics. 2016 Oct 21;17(1):428

【4】Natarajan KN, Miao Z, Jiang M，et al. Comparative analysis of sequencing technologies for single-cell transcriptomics. Genome Biology. 2019 Apr 9;20(1):70.