實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟 

1 樣品RNA的抽提 

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯fang，蓋緊管蓋。手動劇烈

振蕩管體15秒后，15 到30℃孵育2 到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后

混合液體將分為下層的紅色酚氯fang相，中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配于水相

中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。 

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀

其中的 RNA，混勻后15 到 30℃孵育 10 分鐘后，于 4℃下 12000rpm 離心 10 分鐘。此

時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。 

④RNA 清洗 移去上清液，每 1mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1ml 的 75%乙醇

（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。  

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。  

⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時(shí)，先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反復(fù)吹打幾次，使其完

全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 

2 RNA質(zhì)量檢測 

1）紫外吸收法測定 

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量 RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，

讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。 

① 濃度測定 

A260下讀值為1表示 40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋

倍數(shù)× 40 µg/ml。具體計(jì)算如下： 

RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495µl的TE中，測得A260 = 0.21 

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl  

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 µl，剩余 RNA總量為： 

35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg 

②純度檢測 

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。 

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定 

①制膠 

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 

甲醛溶液(12.3 M)。 

10×MOPS電泳緩沖液 

濃度  成分  

0.4M  MOPS，pH 7.0 

0.1M  乙酸鈉 

0.01M  EDTA 

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽

內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。 

②準(zhǔn)備RNA樣品 

取3µgRNA，加 3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。

加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。 

③電泳 

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭

指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。 

④紫外透射光下觀察并拍照 

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上

面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由

低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到

一片彌散的 EB 染色物質(zhì)，可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過程中如果

出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或

者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。 

3樣品cDNA合成 

①反應(yīng)體系 

序號  反應(yīng)物  劑量 

1  逆轉(zhuǎn)錄buffer  2μl 

2  上游引物  0.2μl 

3  下游引物  0.2μl 

4  dNTP  0.1μl 

5  逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV  0.5μl 

6  DEPC水  5μl 

7  RNA模版  2μl 

8  總體積  10μl 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫

度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。 

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。 

4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR  

①β-actin 陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為 1011，反應(yīng)前取 3μl 按 10 倍稀釋

（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②反應(yīng)體系如下： 

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系 

序號  反應(yīng)物  劑量 

1   SYBR Green 1 染料  10μl 

2  陽性模板上游引物F  0.5μl 

3  陽性模板下游引物R  0.5μl 

4  dNTP  0.5μl 

5  Taq酶  1μl 

6  陽性模板DNA  5μl 

7  ddH2O  32.5μl 

8  總體積  50μl 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 

管家基因反應(yīng)體系： 

序號  反應(yīng)物  劑量 

1  SYBR Green 1 染料  10μl 

2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl 

3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl 

4  dNTP  0.5μl 

5  Taq酶  1μl 

6  待測樣品cDNA  5μl 

7  ddH2O  32.5μl 

8  總體積  50μl 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 

③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分

鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。 

5 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板 

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 

反應(yīng)體系： 

序號  反應(yīng)物  劑量 

1  10× PCR緩沖液  2.5 ul 

2  MgCl2 溶液  1.5 ul 

3  上游引物F  0.5 ul 

4  下游引物R  0.5 ul 

5  dNTP混合液  3 ul 

6  Taq聚合酶  1 ul 

7  cDNA  1 ul 

8  加水至總體積為  25ul 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 

35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72ºC延伸5分鐘。 

②PCR 產(chǎn)物與 DNA Ladder 在 2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測 PCR 產(chǎn)物是否

為單一特異性擴(kuò)增條帶。 

③將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 10 倍梯度稀釋: 將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 10 倍梯度稀釋: 設(shè)定 PCR 產(chǎn)物濃度

為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 

6 待測樣品的待測基因?qū)崟r(shí)定量PCR  

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。 

體系配置如下： 

序號  反應(yīng)物  劑量 

1  SYBR Green 1 染料   10 ul 

2  上游引物  1ul 

3  下游引物  1ul 

4  dNTP   1ul 

5  Taq聚合酶  2ul 

6  待測樣品cDNA  5ul 

7  ddH2O   30ul 

8  總體積  50 ul 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃

2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，后72℃

7分鐘延伸。 

7 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表 

引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物

與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合

反應(yīng)(即錯配)。 

8 電泳 

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在

2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView™染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。