大家在讀醫(yī)學(xué)研究文獻(xiàn)時(shí)常常會(huì)看到1種不明覺厲的研究技術(shù)，叫“Acyl-biotinyl Exchange”，

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翻譯過來就是“?；?/span>-生物素交換法”。這種方法主要用于研究蛋白質(zhì)所發(fā)生的翻譯后修飾。

大多數(shù)蛋白分子都有多個(gè)不同的翻譯后修飾機(jī)制，用以調(diào)節(jié)蛋白功能。蛋白質(zhì)zui常見的翻譯

后修飾方式叫磷酸化，主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸等殘基位點(diǎn)上，常常通過特異性的抗體進(jìn)

行檢測(cè)。

除了磷酸化之外，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的方式還有很多，例如糖基化、乙?；?、甲基化、亞

硝基化、谷胱甘肽化、棕櫚酰化等等。探索蛋白質(zhì)翻譯后修飾的生物學(xué)意義是是生命科學(xué)的

研究熱點(diǎn)之1。

對(duì)于醫(yī)學(xué)研究而言，如果你在課題研究過程中發(fā)現(xiàn)某種新報(bào)道的蛋白質(zhì)翻譯后修飾剛好參與

調(diào)控疾病過程中該蛋白的功能變化，那么恭喜你，1篇不錯(cuò)的好文章已經(jīng)在不遠(yuǎn)處招手啦。

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酰基-生物素交換法是1種常見的檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方法。蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上

的巰基基團(tuán)，由于其高反應(yīng)性，很容易發(fā)生各種氧化還原反應(yīng)或?；磻?yīng)。?；?/span>-生物素交

換法的實(shí)質(zhì)是將所要檢測(cè)的翻譯后修飾轉(zhuǎn)化為?；纳锼鼗鶊F(tuán)。

整個(gè)交換過程要分三步完成：

第1步，先封閉可能干擾檢測(cè)的噪音，就是其他可被生物素?；陌被釟埢鶊F(tuán)；

第二步，通過某種方式將所檢測(cè)的翻譯后修飾特異性的轉(zhuǎn)變成可進(jìn)行?；磻?yīng)的狀態(tài)，如

還原態(tài)的巰基狀態(tài)或游離的胺基狀態(tài)；

第三步，將生物素通過?；磻?yīng)，結(jié)合那些轉(zhuǎn)變生成的可發(fā)生翻譯后修飾的氨基酸殘基。

這樣，原來的蛋白質(zhì)翻譯后修飾會(huì)交換成?；纳锼?。再通過可以選擇性結(jié)合生物素的

親和素制備層析柱，就可以富集這些生物素化的蛋白，再通過抗體11檢測(cè)。

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亞硝基化修飾是1種發(fā)生在半胱氨酸殘基巰基上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對(duì)很多心腦血管疾病

相關(guān)的蛋白功能有重要的調(diào)節(jié)效應(yīng)。以亞硝基化為例，可以幫助我們了解如何通過酰基-生物素交換法來研究蛋白質(zhì)的翻譯后修

飾。下面讓我們1起看看如何在實(shí)驗(yàn)室里通過?；?/span>-生物素交換法檢測(cè)某個(gè)蛋白亞硝基化水

平吧。

首先，工欲善其事必先利其器。不要嫌麻煩，認(rèn)認(rèn)真真的配制幾種溶液吧。

第1種，叫 HEN buffer（11.9150gHepes 羥乙基哌qin乙磺酸. NaOH，0.0584g 乙二胺四乙酸，

0.004166g 新亞銅樹堿，加入到 200 ml 超純水中），這可是整個(gè)?；锼亟粨Q反應(yīng)發(fā)生的

基礎(chǔ)緩沖液哦。

第二種，叫 HENS buffer，就是在 HEN buffer 的基礎(chǔ)上，加入1定比例的 SDS（1般是把 HEN

buffer 和 25%的 SDS 按 9:1 配好）。

第三種，叫裂解液，是在第1種 HEN buffer 的基礎(chǔ)上，每毫升體積里加入 1% 的 NP40 10 μl，

protease inhibitor cocktail 10μl，1 mM 的 PMSF 10μl。裂解液是zui先用到的液體，用于破碎

細(xì)胞或組織。

第四種，叫洗脫液，在第二種 HENS buffer 的基礎(chǔ)上，加入 DTT 配制而成（1般 DTT 的終濃

度為 100-200mM）。

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然后，我們就可以按照上面介紹的三大步，對(duì)蛋白質(zhì)上亞硝基化修飾的巰基來進(jìn)行 Acyl

biotinyl Exchange Reaction 了。

第1步，封閉可能產(chǎn)生干擾的噪音：將細(xì)胞或組織樣本按 10μl/mg 或 500μl/孔（六孔板）

加入裂解液，在冰上進(jìn)行超聲裂解處理 5 分鐘, 立即 4℃下 12000g，離心 15 分鐘。取上清，

加入 4 倍體積的 blocking buffer。

所謂的 blocking buffer，就是在每 ml HENS buffer 中加入 10ul MMTS 儲(chǔ)液（MMTS 的全稱是

methyl methanethiosulfonate，是1種特異性的巰基封閉劑，用二甲基甲酰胺配制到 2M 的儲(chǔ)

液濃度）。封閉反應(yīng)在 50℃的恒溫水箱中進(jìn)行，1般要 20 分鐘到半小時(shí)。

第二步，將亞硝基化修飾的巰基轉(zhuǎn)化為可進(jìn)行酰基化反應(yīng)的游離巰基：把裂解液轉(zhuǎn)入

離心管里。在離心管中1次性加滿-20 攝氏度的丙酮，-20℃下靜置 40 分鐘，立即 4℃，5000g

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離心 20 分鐘，去除上清。

重復(fù)步驟三次后得到比較純凈的蛋白質(zhì)。去除丙酮上清后，向沉淀加入用 HENS buffer 所配

制的維生素 C (20 mM,1ml)，溶解蛋白并將亞硝基化信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭甚；膸€基分子。

第三步，將生物素通過?；磻?yīng)結(jié)合這些轉(zhuǎn)變生成巰基。加入用 HENS buffer 所配制

的生物素 biotin–HPDP（1mM, 1ml），室溫下孵育 2 小時(shí)（用搖床，1定注意避光）。反應(yīng)完

成后再用丙酮沉淀的方法，去除反應(yīng)液里小分子，制備純化蛋白。

把反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入離心管里。在離心管中1次性加滿-20 攝氏度的丙酮，-20℃靜置 40 分鐘，

立即 4℃，5000g 離心 20 分鐘，去除上清。重復(fù)步驟三次。用 2~3ml 的 HENS buffer *溶

解沉淀物。

zui后，我們還有1個(gè)很關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)步驟，就是從1堆蛋白質(zhì)里把亞硝基化修飾的蛋

白分揀出來進(jìn)行抗體檢測(cè)。不要忘了哦，此時(shí)，那些原本亞硝基化修飾的蛋白質(zhì)早已被換

成了帶有酰基生物素標(biāo)簽的蛋白，找出它們可1點(diǎn)也不難。

我們用1種填料親和素-agarose 制備成親和層析小柱，這可是個(gè)很高大上的玩意，可以把帶

有?；锼貥?biāo)簽的蛋白統(tǒng)統(tǒng)結(jié)合上去。

將溶解沉淀蛋白的 HENS 液灌注親和素-agarose 洗脫柱,循環(huán)多次，并用洗脫液沖洗灌注親和

素-agarose 洗脫柱（確保洗脫液充滿整個(gè)柱體），在 100℃時(shí)處理 20 分鐘后，打開親和素-

agarose 洗脫柱下蓋，收集含目標(biāo)蛋白洗脫液，并且用洗脫液繼續(xù)沖洗 2~3 次。收集蛋白。

?；?/span>-生物素交換法的步驟雖然比較復(fù)雜，但是并不需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，屬于成本不高但

逼格很高。基本上可以做 WESTERN BLOTTING 實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都可以做這方面的研究。

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而且，做疾病模型中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的文章還不算很多，相當(dāng)搶手，可以多多關(guān)注哦。

注意事項(xiàng)：

不是所有蛋白都會(huì)發(fā)生亞硝基化修飾。先做好文獻(xiàn)調(diào)研。維生素 C 還原處理的時(shí)間不宜太長(zhǎng)。

Biotin–HPDP 配成儲(chǔ)液后分裝成小支。

丙酮沉淀蛋白后要盡量吹干或揮干里面的丙酮?dú)埩簟?

親和素-agarose 洗脫柱填裝制備時(shí)要注意推平，不要產(chǎn)生縫隙或氣泡。

如果對(duì)該技術(shù)有興趣，推薦幾篇文獻(xiàn)看1看：

1.ffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH (2001) Protein S-nitrosylation: a

physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol 3:193–197.

2.ffrey SR, Fang M, Snyder SH (2002) Nitrosopeptide mapping: a novel methodology reveals S

nitrosylation of dexras1 on a single cysteine residue. Chem Biol 9:1329 –1335.

3.stafa AK, Kumar M, Selvakumar B, Ho GP, Ehmsen JT, Barrow RK, Amzel LM, and Snyder SH (2007).

Nitric oxide S-nitrosylates serine racemase, mediating feedback inhibition of D-serine formation.

Proc Natl Acad Sci USA 104: 2950-2955.