1從培養(yǎng)的CCLE細(xì)胞系中提取代謝產(chǎn)物

體外培養(yǎng)20種主要癌癥類型的928個(gè)癌細(xì)胞系，用于124種極性代謝物和101種脂類的代謝組學(xué)分析(圖1a)。使用層次聚類來評(píng)估細(xì)胞系之間的代謝相似性。兩個(gè)主要的聚類與造血系和非造血系有很強(qiáng)的相關(guān)性，表明這兩組的主要代謝是有差異的(p<1×10−10,Fisher’s確切檢驗(yàn))。為了進(jìn)一步量化代謝物水平(y)與主要癌癥譜系(X)的關(guān)系程度，采用線性回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，225個(gè)代謝物中有148個(gè)的譜系效應(yīng)(定義為r²)大于0.1，表明這些代謝物中至少有10%的跨細(xì)胞系代謝物水平差異與譜系相關(guān)。同時(shí)評(píng)估了主要癌癥譜系中每種代謝物的平均豐度表明不同腫瘤細(xì)胞系代謝譜圖存在差異。例如，磷酸肌酸在食道細(xì)胞系中積累，而在腎臟或造血系中不積累，相比之下，1-甲基煙酰胺在大多數(shù)腎臟和胸膜細(xì)胞系中含量豐富，但在許多其他譜系中含量較低。

2代謝物與遺傳特征的關(guān)系

除了譜系外，癌癥中的遺傳或表觀遺傳事件也可能改變細(xì)胞代謝。為了識(shí)別可能由遺傳差異引起的代謝變異，我們構(gòu)建了一個(gè)包含705個(gè)基因突變和61個(gè)擴(kuò)增/缺失的遺傳特征矩陣。應(yīng)用線性回歸模型尋找這些遺傳特征和代謝物水平之間的聯(lián)系(圖1c)。遺傳特征通過與每個(gè)代謝物的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)分，并按統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的順序進(jìn)行比較。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械相關(guān)特征往往與異常代謝物水平具有很強(qiáng)的相關(guān)性。下面將討論所選的示例。

首先，無偏比較結(jié)果顯示，對(duì)于2-羥基戊二酸鹽(2HG)來講，IDH1熱點(diǎn)錯(cuò)義突變是首要的預(yù)測(cè)遺傳特征(圖1d)。具有這種代謝物異常積累的細(xì)胞系大多是IDH1/IDH2突變體(圖1e)，與已有報(bào)導(dǎo)相符。值得注意的是,雖然CCLE中并沒有已知的腎細(xì)胞癌(RCC)株系有IDH1 / IDH2突變,其他株系效應(yīng)分析表明，RCC株系中平均2HG含量比其他株系中多三倍，這與已有研究結(jié)果相吻合。

總而言之，通過代謝物和各種遺傳特征之間的無偏關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)了先前發(fā)現(xiàn)的將致癌因子變化(如IDH1/KEAP1/ME2)與異常代謝物相關(guān)。

3 DNA甲基化調(diào)節(jié)代謝物豐度

接下來，我們檢測(cè)DNA甲基化并評(píng)估其與代謝物水平的關(guān)系。2114個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本與其啟動(dòng)子CpG甲基化水平顯著相關(guān)。相關(guān)系統(tǒng)分析揭示與潛在的代謝失調(diào)相關(guān)的數(shù)量驚人的特異性改變(圖2a)。這些觀察結(jié)果可分為兩類：

1、DNA高甲基化似乎通過抑制某些代謝物降解途徑來影響代謝物水平，例如，SLC25A20的甲基化與長(zhǎng)鏈類?；鈮A(如油基肉堿)的積累具有很強(qiáng)的相關(guān)性(圖2b)。SLC25A20，也被稱為肉堿/?；鈮A轉(zhuǎn)位酶，使酰基肉堿通過線粒體內(nèi)膜進(jìn)行脂肪酸氧化。SLC25A20高甲基化與標(biāo)記的mRNA轉(zhuǎn)錄減少相關(guān)(圖2c), 伴隨著14、16或18個(gè)碳的酰基鏈的?；鈮A類物質(zhì)顯著升高 (圖2 d-g), 但與其他具有較短或較長(zhǎng)的?；湹孽；鈮A沒有關(guān)系，這表明在這些細(xì)胞系中存在一種不尋常的脂肪酸分解代謝缺陷。

2、DNA高甲基化似乎通過限制生物合成途徑的成分來調(diào)節(jié)代謝水平。例如，脯氨酸水平的降低與PYCR1的高甲基化有關(guān)，PYCR1是一種將吡咯啉-5-羧酸鹽轉(zhuǎn)化為脯氨酸的酶(圖2h，i)。此外，丙氨酸水平的降低與GPT2的高甲基化有關(guān)，GPT2可以通過轉(zhuǎn)胺作用合成丙氨酸

4 代謝物依賴關(guān)系分析 

長(zhǎng)期以來，人們一直希望利用失調(diào)的癌癥代謝狀態(tài)進(jìn)行治療。為此，我們?cè)噲D將代謝變化與DepMap CRISPR-Cas9敲除數(shù)據(jù)集揭示的癌癥缺陷聯(lián)系起來，在該數(shù)據(jù)集中，483個(gè)CCLE細(xì)胞系已經(jīng)通過針對(duì)~17,000個(gè)基因的~74k sgRNAs文庫(kù)進(jìn)行了篩選。利用CERES評(píng)分來總結(jié)基因水平依賴性(較小的值表示對(duì)基因敲除更敏感)，然后就代謝物的變化詢問每個(gè)基因水平依賴性。這一無偏的代謝依賴相關(guān)分析表明，在癌細(xì)胞株中觀察到的不同代謝表型與不同的基因依賴相關(guān)，因此具有潛在的治療靶點(diǎn)(圖3a)。首先，氧化還原代謝物(包括GSH、GSSG和NADP+)的異常積累(部分歸因于KEAP1突變，見上述分析)與NFE2L2 (NRF2)敲除敏感性增加有關(guān)，NFE2L2是一種參與抗氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子(圖3b-d)。值得注意的是，依賴關(guān)系zui強(qiáng)的是 SLC33A1(圖3b-d)，這是一種乙酰輔酶a轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在氧化還原穩(wěn)態(tài)中的作用目前尚不清楚。同時(shí)發(fā)現(xiàn)較低天冬酰胺水平的細(xì)胞更依賴于其合成酶(ASNS)和EIF2AK4 (GCN2，參與氨基酸饑餓反應(yīng))(圖3e)。此外，我們還觀察到一個(gè)有趣的關(guān)聯(lián)，涉及兩個(gè)不同的甘油三酯(TAG)簇(圖3a)。其中一個(gè)簇包含多不飽和標(biāo)簽種類（多于4個(gè)C=C），另一個(gè)簇包含較少不飽和標(biāo)簽種類及單不飽和脂肪酸?；?MUFA)(圖3a)。為了區(qū)分富含這兩類物質(zhì)的癌細(xì)胞系，我們將其標(biāo)記為高多不飽和脂肪?；?nbsp;(PUFA^high, n=315)或低多不飽和脂肪?；?/span>(PUFA^low, n=325)，排除了那些沒有明顯脂質(zhì)不飽和差異的細(xì)胞系(圖3f)。其他脂類如磷脂酰膽堿(PC，圖3g)和膽固醇酯(CE，圖3h)也存在這種不飽和差異。為了驗(yàn)證這種*的脂質(zhì)利用模式是否與靶標(biāo)依賴相關(guān)，對(duì)比CERES評(píng)分，發(fā)現(xiàn)PUFA^high細(xì)胞系對(duì)GPX4敲除敏感(圖3i)，GPX4敲除介導(dǎo)了過氧化PUFA的解毒作用。相比之下，PUFA^low細(xì)胞系對(duì)合成MUFA的CTNNB1或SCD的缺失很敏感(圖3i)。總之，這些無偏關(guān)聯(lián)分析表明，體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞具有顯著的脂類差異，可以根據(jù)PUFA分類選擇性靶向分析。

5 CCLE細(xì)胞系的表型分析

如上所述，較低的天冬酰胺水平與較高的天冬酰胺合成酶(ASNS)缺失敏感性密切相關(guān)(圖3e)。當(dāng)培養(yǎng)基中天門冬酰胺缺失時(shí)，ASNS基因的下調(diào)明顯阻礙了細(xì)胞的增殖。考慮到一些具有ASNS啟動(dòng)子高甲基化的CCLE細(xì)胞系，即使存在其轉(zhuǎn)錄激活因子ATF4，其ASNS表達(dá)也異常低(Fig.4a), 因此推測(cè)內(nèi)在甲基化依賴型基因抑制可能通過特定的營(yíng)養(yǎng)剝奪來選擇性靶向目標(biāo)基因。為了探索這個(gè)問題，使用有24個(gè)核苷酸barcodes標(biāo)記的544種的CCLE細(xì)胞株(圖4b)在氨基酸組成明確的條件種培養(yǎng)，并在處理6天后使用barcode高通量測(cè)序方法評(píng)估細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在限制天冬酰胺條件下生長(zhǎng)時(shí)，那些異常低表達(dá)的ASNS被選擇性地耗盡(圖4 c)。類似的，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)ASS1和GLUL(啟動(dòng)子區(qū)域甲基化影響)標(biāo)記的細(xì)胞表達(dá)較低，它們對(duì)精氨酸供應(yīng)減少更敏感，對(duì)谷氨酰胺也更敏感 (圖4d, e)。綜上所述，這些例子表明，DNA高甲基化影響了對(duì)營(yíng)養(yǎng)有效性的依賴，例如癌細(xì)胞亞群中的天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)缺乏。

6 擴(kuò)展天冬酰胺酶的治療作用

前面的表型現(xiàn)象促使我們探索天冬酰胺酶的潛在治療價(jià)值超出急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的范圍。我們證實(shí)ASNS高甲基化的細(xì)胞也缺乏蛋白表達(dá)(圖5a-c)，并且在體外對(duì)天冬酰胺酶非具有高度敏感性 (圖5d)。為了確定該依賴性是否也存在于體內(nèi)，將7*10⁶的2313287 (ASNS^high)或SNU719 (ASNS^low)細(xì)胞分別植入裸鼠的兩側(cè)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-200 mm³左右時(shí)，用天冬酰胺酶腹腔注射(3000單位/kg/注射，每周5次)或空白對(duì)照的方法對(duì)小鼠進(jìn)行治療，并在3周內(nèi)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)SNU719腫瘤的生長(zhǎng)明顯下降，而2313287腫瘤的生長(zhǎng)幾乎沒有下降(圖5e)。還發(fā)現(xiàn)，在植入和治療這些異種移植腫瘤的過程中，ASNS的高甲基化和表達(dá)丟失得以維持(圖5f)。這些數(shù)據(jù)也表明ASNS免疫組化可能被應(yīng)用于天冬酰胺酶試驗(yàn)的患者分類和選擇。同時(shí)檢測(cè)癌癥基因組圖譜(TCGA)中胃癌和肝癌的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)它與腫瘤樣本中ASNS表達(dá)的降低顯著相關(guān)(圖5g)?？傊?，這些結(jié)果表明，天冬酰胺酶可以抑制腫瘤細(xì)胞系的特定亞群的生長(zhǎng)，同時(shí)在體內(nèi)和體外都可以抑制ASNS的表達(dá)。

7 CCLE中犬尿氨酸代謝譜圖

除了分析具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的代謝物外，我們還探索了包括犬尿氨酸在內(nèi)的信號(hào)代謝物的模式。犬尿氨酸由色氨酸分解代謝產(chǎn)生，通過芳基烴類受體(AHR)發(fā)揮免疫抑制作用，抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了針對(duì)犬尿氨酸通路的IDO1抑制劑聯(lián)合PD1阻斷劑的臨床試驗(yàn)。在CCLE中，我們觀察到跨越多個(gè)癌癥類型的三個(gè)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞內(nèi)犬尿氨酸濃度 (圖6a)。我們發(fā)現(xiàn)，在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的細(xì)胞系中，細(xì)胞內(nèi)較高的犬尿氨酸水平與培養(yǎng)基中分泌更多的犬尿氨酸密切相關(guān) (圖6b)。這些數(shù)據(jù)表明，具有較高細(xì)胞內(nèi)犬尿氨酸濃度的細(xì)胞系也在積極地將其分泌到細(xì)胞外空間。通過將mRNA轉(zhuǎn)錄本(n=18,205)與犬尿氨酸水平相關(guān)聯(lián)，我們發(fā)現(xiàn)IDO1、IDO2和TDO是與犬尿氨酸水平顯著相關(guān)的zui熱門的三個(gè)位點(diǎn)(圖6c)。有趣的是，我們?cè)?/span>IDO1/2或TDO mRNA水平高的細(xì)胞系中觀察到豐富的細(xì)胞內(nèi)犬尿氨酸(圖6d)。根據(jù)癌細(xì)胞IDO (IDO1為主要形式)和TDO的表達(dá)，我們將全尿酸含量高的癌細(xì)胞兩類，約有三分之一的癌細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IDO1和TDO，其余的由IDO1或TDO驅(qū)動(dòng)(圖6e)。在TCGA的不同腫瘤樣本中也可以觀察到這種差異表達(dá)模式(圖6f)。這表明，癌細(xì)胞可能使用酶或潛在的兩者都產(chǎn)生犬尿氨酸。接下來，我們研究了IDO1選擇性抑制劑epacadostat是否在這些不同的環(huán)境中有效阻斷犬尿氨酸的分泌。為了在體外驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們?cè)谌齻€(gè)有代表性的細(xì)胞系中研究了epacadostat對(duì)犬尿氨酸分泌的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn)epacadostat*抑制NCIH596 (IDO1^high)的犬尿氨酸分泌，導(dǎo)致IGR39 (IDO1^high + TDO^high)的犬尿氨酸分泌大量減少，而對(duì)JHH7 (TDO^high)的影響很小(圖6g)。因此，這些將高犬尿氨酸與IDO1或TDO mRNA表達(dá)聯(lián)系起來的數(shù)據(jù)表明，選擇性的IDO1抑制可能只在這些腫瘤的一個(gè)亞群中起作用，并且可能進(jìn)一步受到TDO介導(dǎo)的逃逸。zui近，關(guān)于epacadostat與抗PD-1抗體pembrolizumab聯(lián)合應(yīng)用于未被選擇的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的III期陰性數(shù)據(jù)被報(bào)道，我們的數(shù)據(jù)提出了這樣一種可能性，即選擇腫瘤中犬尿氨酸含量增加的患者，同時(shí)了解哪些酶正在產(chǎn)生犬尿氨酸，這可能對(duì)進(jìn)一步開發(fā)IDO/TDO抑制劑至關(guān)重要。