1 AGPG被鑒定為作為代謝相關(guān)的LncRNA

為了發(fā)現(xiàn)對(duì)ESCC發(fā)育有顯著影響的致癌LncRNA，我們首先從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出在ESCC組織中表達(dá)高于成對(duì)相鄰正常組織的LncRNA。然后，我們根據(jù)log2差異倍數(shù)對(duì)這些LncRNA進(jìn)行分類(lèi)。接下來(lái)，我們建立了一個(gè)siRNA庫(kù)，對(duì)于siRNA進(jìn)行篩選，這些siRNAs還包含了TARGETplus上的專有雙鏈化學(xué)修飾，以確保zui佳的鏈負(fù)載和干擾類(lèi)似microRNA的種子活性，從而減少非目標(biāo)效應(yīng)。為了確定可能改變葡萄糖代謝的LncRNA，我們將siRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染到兩個(gè)人ESCC細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞活力和乳酸生成。我們發(fā)現(xiàn)14個(gè)LncRNA可能是細(xì)胞增殖所必需的，10個(gè)參與乳酸的產(chǎn)生，8個(gè)可能參與細(xì)胞活力和葡萄糖代謝（圖1a）。在這8個(gè)低分子RNA中，AGPG基因敲除顯著降低了細(xì)胞活力和乳酸生成（圖1b）。生物信息學(xué)分析顯示，AGPG位于染色體1q32.1上，有3個(gè)外顯子（1-56、10447-10526和11304-13488）。我們關(guān)注的是AC098934.2-201亞型，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，我們將該亞型稱為AGPG。然后，我們?cè)谌耸彻荀[癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞（Het-1A和NE-1）中驗(yàn)證了AGPG的表達(dá)shui平，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的AGPGshui平明顯高于正常細(xì)胞，ESCC細(xì)胞的AGPG拷貝數(shù)也增加（圖1c,d），AGPG在其他ESCC細(xì)胞系中對(duì)細(xì)胞增殖和分泌乳酸的作用也得到進(jìn)一步證實(shí)。

2 AGPG的表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后的關(guān)系

與我們的生物信息學(xué)分析結(jié)果（圖1e）一致，我們發(fā)現(xiàn)高AGPGshui平與ESCC患者的不利總體生存率相關(guān)（圖1f）。與中值相比，我們將基因表達(dá)分為低表達(dá)或高表達(dá)：如果表達(dá)shui平高于中值，則將其分為高表達(dá)，而如果低于中值，則將其分為低表達(dá)。多因素分析也表明AGPG是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，AGPG在多種癌癥中高表達(dá)，包括胃癌（GC）、結(jié)直腸癌（CRC）、肝癌、乳腺癌和肺癌。但在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中，其表達(dá)與正常組織無(wú)明顯差異。此外，在腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌和腎乳頭狀細(xì)胞癌中，AGPGshui平也降低。與許多其他LncRNA類(lèi)似，AGPG在不同癌癥中具有組織特異性表達(dá)模式。接下來(lái)，我們進(jìn)行qRT-PCR和RNAScope原位雜交（ISH）檢測(cè)AGPG在ESCC、GC和CRC組織中的表達(dá)。我們的結(jié)果顯示AGPG在ESCC、GC和CRC組織中高度表達(dá)（圖1g-i）。這些結(jié)果提示AGPG的失調(diào)與癌癥的發(fā)展有著密切的關(guān)系。為了確定AGPG的亞細(xì)胞定位，我們用qRT-PCR方法檢測(cè)了AGPG在胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)。結(jié)果表明，AGPG主要定位于細(xì)胞核，部分定位于細(xì)胞質(zhì)，RNAScope-ISH和RNA熒光原位雜交進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1j-l，補(bǔ)充圖1i）。

3 AGPG促進(jìn)細(xì)胞增殖和糖酵解

由于AGPG可能參與細(xì)胞增殖和乳酸生成，我們進(jìn)一步研究了AGPG在細(xì)胞行為中的功能作用。KYSE150和KYSE30細(xì)胞中的AGPG敲除顯著抑制細(xì)胞增殖和菌落形成（圖2a-d），AGPG敲除阻斷G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換（圖2e、f）。我們還檢測(cè)到了關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白，并觀察到AGPG基因敲除顯著增加了p27的表達(dá)，降低了CDK1的表達(dá)（圖2g），但沒(méi)有改變p21、p53、CDK3或CDK6的表達(dá)。這些結(jié)果提示，AGPG可能通過(guò)調(diào)節(jié)p27等關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白和CDK1介導(dǎo)的G1/S進(jìn)程來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。為了驗(yàn)證AGPG在代謝重編程中的作用，使用細(xì)胞外流量分析儀測(cè)量ESCC細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率（ECAR）（圖2h，i），證明AGPG基因敲除顯著損害糖酵解，這與我們之前的篩選結(jié)果一致。為了進(jìn)一步確定葡萄糖的代謝流量，我們檢測(cè)了¹³C₆葡萄糖孵育2 h后，ESCC細(xì)胞內(nèi)¹³C標(biāo)記的代謝中間產(chǎn)物的數(shù)量（圖2j）?；谝合嗌V和質(zhì)譜（MS）的代謝組分析表明，AGPG基因敲除后糖酵解的細(xì)胞內(nèi)代謝物（3-磷酸甘油酸、丙酮酸和乳酸）明顯減少，進(jìn)一步證實(shí)AGPG對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸至關(guān)重要（圖2k-m）。為了進(jìn)一步確認(rèn)AGPG的功能作用，我們使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)生成了AGPG-CRISPR-KO細(xì)胞，結(jié)果顯示AGPG CRISPR KO顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，AGPG在調(diào)節(jié)腫瘤代謝重編程和腫瘤生長(zhǎng)方面具有重要的功能。

4 AGPG與PFKFB3直接相關(guān)

為了剖析AGPG介導(dǎo)的代謝重塑的分子機(jī)制，我們嘗試通過(guò)RNA pull-down分析和質(zhì)譜分析來(lái)鑒定AGPG相關(guān)蛋白。通過(guò)比較AGPG結(jié)合蛋白和反義AGPG結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)非反義對(duì)照的sense-AGPG與PFKFB3（圖3a）有特異性的相互作用，如前所述，PFKFB3也主要位于細(xì)胞核內(nèi)。通過(guò)發(fā)現(xiàn)AGPG直接結(jié)合到純化His標(biāo)記的重組PFKFB3（圖3b）進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果。AGPG和PFKFB3之間的相互作用也通過(guò)RNA免疫沉淀（RIP）分析得到證實(shí)（圖3c）。為了進(jìn)一步研究AGPG和PFKFB3在體內(nèi)的相互作用，我們進(jìn)行了MTRAP和western blotting，與陰性對(duì)照組相比，MS2-AGPG和MCP-3FLAG質(zhì)粒的共表達(dá)導(dǎo)致PFKFB3顯著富集，表明PFKFB3特異性地與AGPG結(jié)合（圖3d）。免疫熒光共聚焦分析表明，AGPG和PFKFB3主要在細(xì)胞核內(nèi)共聚焦，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有部分共聚焦，提示AGPG-PFKFB3復(fù)合物可能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都起作用（圖3e）。此外，我們用qPCR檢測(cè)AGPG的表達(dá)，用western blotting檢測(cè)PFKFB3在一組ESCC細(xì)胞、12對(duì)ESCC組織和匹配的正常食管組織（SYSUCC）中的表達(dá)。如所料，AGPG的表達(dá)與ESCC中PFKFB3的表達(dá)呈正相關(guān)（圖3f），這進(jìn)一步揭示了AGPG與PFKFB3之間的功能關(guān)系?？傊?，這些結(jié)果表明AGPG和PFKFB3是密切相關(guān)的，它們的相互作用在人類(lèi)癌癥的發(fā)展中起著重要作用。

5 AGPG介導(dǎo)的T5片段與PFKFB3的相互作用

為了定位介導(dǎo)AGPG與PFKFB3相互作用的區(qū)域，我們使用體外合成的全長(zhǎng)（FL）AGPG和T1（1–800）、T2（801–1140）、T3（1141–1700）、T4（1701–2030）和T5（2031–2321）片段進(jìn)行RNA pull-down分析，然后通過(guò)western blotting分析產(chǎn)物。我們證明了T5片段可以與PFKFB3結(jié)合，而其他片段或珠狀對(duì)照不能結(jié)合。用純化的重組PFKFB3進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖3g）。我們還進(jìn)行了CLIP qPCR分析證明T5片段是負(fù)責(zé)結(jié)合PFKFB3的主要區(qū)域（圖3h）。刪除T5片段后，AGPG不能再與PFKFB3相互作用（圖3i）。AGPG FL的過(guò)表達(dá)足以防止AGPG敲除后觀察到的表型，包括糖酵解性重編程和細(xì)胞增殖（圖3j，k）。這些結(jié)果顯示，AGPG與PFKFB3相互作用和調(diào)節(jié)需要T5片段，而下游細(xì)胞過(guò)程可能是通過(guò)AGPG與PFKFB3相互作用介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步確定與PFKFB3結(jié)合的特定基序，我們進(jìn)行了HITS-CLIP，在這些基序中，CCAGCCA或類(lèi)似的基序是高度排序的，可以通過(guò)多種方法識(shí)別。這些數(shù)據(jù)表明AGPG的CCAGCCA基序?qū)ζ浣Y(jié)合PFKFB3和促進(jìn)腫瘤糖酵解重編程的能力很重要。

6 AGPG阻斷APC/C介導(dǎo)的PFKFB3泛素化

由于PFKFB3含有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域，因此構(gòu)建了三個(gè)含有FL（1-520）、N-末端（N，1-245）和C-末端（C 246-520）結(jié)構(gòu)的帶有人類(lèi)標(biāo)記的PFKFB3載體，以鑒定與AGPG相關(guān)的PFKFB3殘基。有趣的是，我們證明AGPG主要與C-末端片段相互作用，與N-末端片段的結(jié)合zui?。▓D4a）。然后，我們使用IgG對(duì)照進(jìn)行RIP分析。如所料，AGPG與PFKFB3的C末端片段一起沉淀（圖4b）。然后，我們?cè)u(píng)估了AGPG-PFKFB3相互作用對(duì)PFKFB3的功能影響。有趣的是，shRNA介導(dǎo)的AGPG基因敲除顯著降低了PFKFB3的表達(dá)（圖4c），這也被CRISPR/Cas9證實(shí)在AGPG-CRISPR-KO細(xì)胞中（圖4d）。此外，過(guò)表達(dá)AGPG FL互補(bǔ)了AGPG缺失引起的PFKFB3shui平下降（圖4d）。這些數(shù)據(jù)表明AGPG可能通過(guò)T5片段調(diào)節(jié)PFKFB3蛋白shui平。并且蛋白酶體抑制劑MG-132恢復(fù)了PFKFB3shui平的降低（圖4e）。PFKFB3包含一個(gè)KEN盒，通過(guò)后期靶向蛋白質(zhì)泛素化測(cè)試，PFKFB3被證明受到涉及一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的E3泛素連接酶APC/C-Cdh1的降解。因此，為了進(jìn)一步闡明AGPG阻斷PFKFB3泛素化的機(jī)制，我們使用PFKFB3和Cdc27抗體進(jìn)行coIP分析，以確定AGPG是否影響PFKFB3和活性APC/C之間的相互作用。結(jié)果顯示AGPG CRISPR KO顯著增加了PFKFB3/Cdc27的相互作用（圖4h），提示AGPG可阻斷Cdc27與PFKFB3的結(jié)合。

7 AGPG是p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)

由于AGPG在腫瘤中高表達(dá)，我們?cè)噲D確定AGPG的調(diào)節(jié)機(jī)制。通路分析表明AGPG表達(dá)與p53呈負(fù)相關(guān)（圖5a）。對(duì)不同TP53基因型的細(xì)胞的分析表明TP53 KO的HCT-116細(xì)胞的AGPGshui平高于對(duì)照細(xì)胞（圖5b），具有WT-TP53（KYSE150）的細(xì)胞表達(dá)的AGPGshui平遠(yuǎn)低于含有突變株（MT）TP53（TE-1和KYSE30）24的細(xì)胞（圖5c）。KYSE150和HCT-116細(xì)胞中WT TP53的過(guò)度表達(dá)降低了AGPGshui平，而TP53的敲除增加了AGPG的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了p53在調(diào)節(jié)AGPG表達(dá)中的作用（圖5d）。此外，通過(guò)qPCR分析，AGPG表達(dá)shui平與WT-TP53的ESCC患者的TP53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖5e，SYSUCC，n = 72）。接下來(lái)，我們確定了p53介導(dǎo)的AGPG調(diào)控所需的區(qū)域，AGPG啟動(dòng)子包含p53結(jié)合序列（圖5f），該序列被識(shí)別為p53結(jié)合區(qū)（p53-BR）（圖5g）。且含有完整p53-BR（p53-BR-wt）的熒光素酶報(bào)告子的轉(zhuǎn)錄活性明顯弱于那些p53-BR缺失的報(bào)告子（p53-BR-mt）。此外，WT-TP53的共轉(zhuǎn)染選擇性地降低了具有完整p53-BR的報(bào)告者的轉(zhuǎn)錄活性（圖5h）。總之，我們的數(shù)據(jù)顯示p53在AGPG轉(zhuǎn)錄中的重要調(diào)節(jié)作用，TP53的丟失或突變導(dǎo)致AGPG的顯著上調(diào)。包括缺氧、DNA損傷和癌基因表達(dá)等多個(gè)微環(huán)境因素下，我們研究了其參與的AGPG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖5i）。在293 T細(xì)胞中，癌基因KRasG12V的表達(dá)導(dǎo)致AGPG上調(diào)和TP53下調(diào)（圖5j），表明癌基因應(yīng)激通過(guò)影響TP53狀態(tài)參與AGPG調(diào)控。我們還將我們的分析擴(kuò)展到缺氧條件下，通過(guò)檢測(cè)暴露于嚴(yán)重缺氧或正常缺氧48小時(shí)的細(xì)胞中AGPG和TP53的表達(dá)。WT和MT p53均如先前報(bào)道的那樣上調(diào)；缺氧后，TP53細(xì)胞（KYSE150）中AGPG的表達(dá)降低，TP53細(xì)胞（TE-1和KYSE30）中AGPG的表達(dá)顯著增加（圖5k）。這些結(jié)果表明，在WT-TP53存在下，缺氧誘導(dǎo)的AGPG上調(diào)可以被抑制。

8 AGPG對(duì)ESCC腫瘤生長(zhǎng)的影響

然后，我們探討了AGPG在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中的作用。AGPG基因敲除顯著抑制了基于細(xì)胞的異種移植瘤生長(zhǎng)（圖6a-c）。如血黃素和曙紅（HE）和免疫組化（IHC）結(jié)果所示，AGPG基因敲除降低了細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67的shui平，降低了PFKFB3和CDK1的shui平，但增加了p27的shui平（圖6d，e）；這些結(jié)果與我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型（使用來(lái)自兩個(gè)ESCC患者的腫瘤組織生成，SYSUCC）（圖6f）中，通過(guò)體內(nèi)優(yōu)化的AGPG抑制劑消耗AGPG顯著降低腫瘤生長(zhǎng)（圖6g-i），表明AGPG是一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。PDX模型中使用的體內(nèi)優(yōu)化AGPG抑制劑的主要成分是反義寡核苷酸，它對(duì)核定位RNAs28具有較強(qiáng)的敲除作用。因此，如HE和IHC分析所示，AGPG基因敲除顯著影響細(xì)胞增殖（Ki67所示），這可能歸因于前面提到的PFKFB3和下游CDK1和p27表達(dá)的調(diào)節(jié)

9 p53-AGPG-PFKFB3軸參與ESCC的形成

為了確定p53-AGPG-PFKFB3是否與ESCC的發(fā)生有臨床關(guān)聯(lián)和病理關(guān)系，我們通過(guò)qPCR和Ki67檢測(cè)了AGPG的表達(dá)，通過(guò)IHC檢測(cè)了PFKFB3、CDK1、p27和p53的表達(dá)。AGPG高組Ki67、PFKFB3和CDK1表達(dá)較高，p27和p53表達(dá)較低，而AGPG低組則相反（圖7a、b）?？傊?，我們推測(cè)p53-AGPG-PFKFB3的失調(diào)促進(jìn)了ESCC的發(fā)展。與之前的報(bào)道一致，PFKFB3在惡性組織中高表達(dá)（圖7c，d），并且PFKFB3高表達(dá)與ESCC患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖7e）。接下來(lái)我們通過(guò)RNAScope-ISH檢測(cè)AGPG在這些組織中的表達(dá)。然后，將組織分為AGPG/PFKFB3高組、AGPG/PFKFB3中間組和AGPG/PFKFB3低組，其中AGPG/PFKFB3高組的預(yù)后比其他組差得多（圖7f）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明AGPG/PFKFB3是一個(gè)有前途的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。