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Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)說明書

來源:上海研謹(jǐn)生物科技有限公司   2020年05月06日 16:54  

                                                                                                                    

Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)說明書

 

6×His-Tagged Protein Purification Kit 

目錄號:  K0894       

保    存:  蛋白酶抑制劑混合物,-20℃;  其它組分,2-8℃。 

 

組分說明 

 

Cat.No.                 K0894         K0894A

KitSize                     2ml            5ml

Ni-Agarose 填料                2ml            5ml

細菌裂解液                   25ml           65ml

1MTris(pH7.9)               6ml           15ml

1M  咪唑                    25ml          65ml

3M 氯化鈉                    50ml         2×60ml

蛋白酶抑制劑混合物             0.3ml          0.7ml

親和柱空柱                  1個(6ml)      1 個 (12ml)

 

產(chǎn)品簡介

 

      本試劑盒包含Ni-Agarose 填料、親和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白純化所需的全部試劑(細菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分),使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有 6 個組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個 Ni2+ 螯合位點,較只有3 個螯合位點的Ni-IDA 結(jié)合 Ni2+ 更為牢固,有效防止純化過程中 Ni2+ 脫落且增強對 His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,提高純化效率。較高的基團密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對來源于各種表達系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細胞,酵母以及細菌)中的His 標(biāo)簽蛋白,均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接用可溶性蛋白的純化,使用方便,快捷。

      支 持 物: CL-6B 瓊脂糖凝膠

      載量:20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料

      粒徑:50-160 μm

 

注意事項 

 

 1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性,本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化,如需純化包涵體蛋白,請選擇我公司的包涵體蛋白純化試劑盒,貨號為K0893。

 2. 緩沖液中不建議使用 β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

 3. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

 4. 為提高純化效率,首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的*使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度,BindingBuffer 的范圍為 0-10mM,洗脫緩沖液的范圍為10-500mM來進行。并通過SDS-PAGE或WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。

 5. 請使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞,建議將裂解液進行離心,或者使用0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。

           

  6. 柱再生時,保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

 

操作步驟 

 

組裝層析柱 

  1. 將填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開,讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

 

      注意:(1)填料的上層是乙醇保護層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計算,取需要的填料與乙醇的混合 液加入層析柱。

 

(2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個外力,例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。

 

(3)本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

  2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用 10 倍柱體積的Binding Buffer 平衡柱子,平衡結(jié)束后即可上樣。

 

注意:柱體積指的是填料的體積。

可溶性蛋白的純化(BindingBuffer和ElutionBuffer配方詳見附表1) 

  1.  收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml細菌裂解液(每1ml 細菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物),超聲裂解菌體。

 

注意:(1) 當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時,建議加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 細菌抽提試劑中加入1μlDNaseI(1,000U/ml),2μlLysozyme(50mg/ml),DNaseI和Lysozyme可單獨從我公司購買,貨號:Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A),如使用其它公司產(chǎn)品,請按照相應(yīng)說明書操作。

(2)超聲過程中保持菌液處于冰浴中,超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率,探頭種類,容器的大小形狀,需實驗中自己摸索,應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱,可分成短時間,多次超聲,通過一定的間隔時間避免溶液過熱。終以菌液變清即可。

  2.  10000rpm,4℃離心3分鐘,收集上清中的可溶性蛋白。

  3.  用BindingBuffer將菌體裂解液等倍稀釋后負載上柱,流速為10倍柱體積/小時,收集流穿液。

 

注意:(1)本試劑盒中附帶有一塊篩板,使用時先將篩板加至填料的上層,該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾,防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負載上柱,但是篩板放入柱子后就不易取出。

 

(2)通過控制加入的菌體裂解液的速度來控制流速。

  4.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,洗去雜蛋白。

  5.  使用適量Soluble Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

 

      注意:洗脫峰可以分管收集,每1ml收集1管,并采用蛋白監(jiān)測儀監(jiān)測,收集洗脫峰。

  6.  洗脫后,依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。

 

      注意:如果是分段梯度洗脫,大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達到500mM時,則使用濃度為500mM的咪唑進行洗脫10倍柱體積后,再進行第6步的操作。

 

柱再生

      當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍綠色),可以用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

  1. 使用2 倍柱體積的6M鹽酸胍沖洗后,使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

  2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。

  3. 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗,再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。             

 4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液(PH8.0)沖洗。

 6. 使用3 倍柱體積去離子水,3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5個柱體積50 mM NiSO4再生,3 個柱體積的Binding Buffer平衡。

 

 

                                         附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                         

成分                   Tris-HCl(PH7.9)   咪唑       NaCl

 

SolubleBindingBuffer       20mM          10mM       0.5M

 

SolubleElutionBuffer       20mM        500mM         0.5M



 

實驗代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費代檢測

CCK8檢測

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

 

免疫組化

熒光定量PCR

動物模型服務(wù)

流式細胞檢測

細胞增殖

激光共聚焦

DNA甲基化實驗

細胞劃痕

鈣離子濃度檢測

掃描電鏡實驗

microRNA 測序

動物實驗

Taqman探針

ATP/ADP檢測

 

石蠟/冰凍切片

定點突變

線粒體膜電位(MMP)檢測

細胞生長曲線的測定

藥理毒理動物實驗

 

免疫共沉淀

真核表達載體構(gòu)建

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

非標(biāo)定量(Label-free)實驗

 

                                                                                                                       

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