Bio-rad微滴式數(shù)字PCR（DDPCR）技術(shù) 

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革命性的微滴式數(shù)字

 PCR技術(shù),使實(shí)體瘤腫瘤負(fù)荷的血清學(xué)定量分析成為可能   

Revolutionary Droplet Digital PCR,Enable Absolute Quantification of Serum Tumor Burden   技術(shù)原理   

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行逐一分析，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。   

技術(shù)優(yōu)勢(shì)   

通過(guò)把樣本稀釋成許多部分，然后在一個(gè)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)候?qū)ζ溥M(jìn)行計(jì)數(shù)。其靈敏度高達(dá)0.001%，顯著高于擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（0.1%）和Sanger法測(cè)序（10%）。同時(shí)能克服核酸降解的不利影響，非常適合一些稀有樣本中核酸的精確檢測(cè)。   

高靈敏度、高特異性檢測(cè)復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列   

靈敏度可達(dá)0.001%，樣本珍貴或者樣本核酸存在降解時(shí)的*選擇。在穿刺樣本、胸腹水、外周血中即可完成靶標(biāo)序列的檢測(cè)。   

所需樣本量少   

200ul血漿或1ml全血/  2-3片白片/  納克級(jí)活檢組織。   

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析便捷   

每個(gè)微滴的檢測(cè)結(jié)果以陰性、陽(yáng)性判讀，數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化。   

可統(tǒng)計(jì)突變率   

真正意義上的定量，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析可得出靶點(diǎn)的突變率。   

臨床應(yīng)用   

腫瘤早期篩查   

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)作為迄今為止zui靈敏的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞突變DNA的手段，可有效應(yīng)用于腫瘤的早期篩查。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)可以通過(guò)檢測(cè)患者外周血樣對(duì)進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤組織核酸進(jìn)行分析，相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法，有更高的靈敏度，可以更好的勝任稀有變異檢測(cè)的工作，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)微滴式數(shù)字PCR可以實(shí)現(xiàn)0.001%的突變頻率篩查。   

腫瘤病理學(xué)輔助診斷   

微滴式數(shù)字PCR的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是所需樣本量很低，這對(duì)于臨床來(lái)說(shuō)特別有意義，尤其是當(dāng)病理樣本太少時(shí)，DDPCR可以幫助檢測(cè)突變，來(lái)輔助診斷對(duì)藥物的敏感性。另外在腫瘤均質(zhì)細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)單一突變相對(duì)簡(jiǎn)單，但是如果在異質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，在僅存有少量攜帶突變腫瘤細(xì)胞的情況下，突變的特定等位基因是否可以被準(zhǔn)確檢測(cè)到，直接影響到靶向治療是否有效。微滴式數(shù)字PCR 在進(jìn)行突變/稀有變異檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用，是臨床腫瘤樣本靶向藥物分子檢測(cè)的*。   

圖1.在外周血中檢測(cè)肺癌患者不同濃度樣本的EGFR第21號(hào)外顯子的突變率   

腫瘤負(fù)荷的實(shí)時(shí)監(jiān)控   

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)由于可以檢測(cè)外周血循環(huán)細(xì)胞中微量腫瘤細(xì)胞突變DNA，成為進(jìn)行腫瘤負(fù)荷實(shí)時(shí)監(jiān)控的有效手段，判斷患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷更加科學(xué)、可靠、及時(shí)。   

 圖2.通過(guò)在外周血中檢測(cè)肺癌患者KRAS基因某一位點(diǎn)的突變率，來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷   

藥物耐藥突變外周血監(jiān)控   

目前，許多腫瘤常規(guī)化療效果差，預(yù)后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性則是腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素。經(jīng)治療后，殘存的腫瘤干細(xì)胞耐藥性形成，常導(dǎo)致對(duì)某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移，因此，對(duì)藥物耐藥突變的篩選和監(jiān)控成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。