樣品粉碎是提取毛發(fā)皮質(zhì)醇非常關(guān)鍵的一步，從相關(guān)文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)Davenport等對(duì)這一步驟的改進(jìn)：起初為剪碎，后來(lái)使用了德國(guó)萊馳MM200 進(jìn)行研磨粉碎。我們使用了德國(guó)萊馳MM400，并在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上做了一定改進(jìn)：將樣品放入液氮內(nèi)充分冷凍變脆后，再進(jìn)行研磨，這樣既可以使研磨粉末更細(xì)、更均勻，又可以避免研磨過(guò)程中局部高溫對(duì)樣品造成的影響。

    終用甲醇進(jìn)行提取。

    具體操作步驟：

（1）稱取 500 mg毛發(fā)樣品置于 15 mL玻璃試管中，加入10 mL異丙醇。在室溫下將該試管放于調(diào)速多用振蕩器上洗滌 3 min（頻率 100 次/min），共洗滌 2 次；洗滌后的樣品置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)，37℃干燥 8 h。

（2）干燥后將樣品放入 80 mL小燒杯內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎。之后放入 25 mL不銹鋼研磨罐內(nèi)（內(nèi)有 15 mm不銹鋼研磨球一個(gè)），擰緊后將罐放入液氮內(nèi)冷凍至液氮停止沸騰。將研磨罐裝入冷凍混合型球磨儀MM400，研磨 2.5 min（頻率 26 Hz）。

（3）稱取400 mg毛發(fā)粉末a，置于 10 mL離心管內(nèi)，并加入 8 mL甲醇。室溫下，將離心管置于振蕩器，振蕩 24 h（頻率 230 次/min），提取皮質(zhì)醇。

（4）將離心管離心 5 min（離心力 12 000 g,），取 4 mL上清液移入 5 mL離心管內(nèi)。

（5）在 5 mL離心管內(nèi)取 2 mL上清液放入2 mL離心管，室溫用氮?dú)饬鬟M(jìn)行干燥，樣品干燥后，加入 5 mL離心管內(nèi)的剩余樣品，繼續(xù)干燥（隨著甲醇的揮發(fā)，離心管內(nèi)出現(xiàn)懸浮物。我們對(duì)這些懸浮物進(jìn)行了研究）。

（6）干燥后加入 0.5 mL PBS (磷酸緩沖液：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2 HPO4 1.44 g, KH2 PO4 0.24 g，加去離子水定容至 1 L，將pH值調(diào)整到7.4)對(duì)樣品進(jìn)行重構(gòu)。振蕩混勻后，放入−20℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存至檢測(cè)日。
 

2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)