PCR實(shí)驗(yàn)室儀器：

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí) PCR 反應(yīng)的基本原理，掌握 PCR 的基本操作技術(shù)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
PCR 用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的 DNA區(qū)段，即通過(guò)引物延伸而進(jìn)行的重復(fù)雙向
DNA合成。
基本原理及過(guò)程如下：
PCR 循環(huán)過(guò)程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定 DNA
聚合酶進(jìn)行 DNA合成。
1． 變性：加熱使模板 DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單
鏈，即變性階段。
2． 退火：在體系溫度降至 37-65℃，模板 DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，使引物
與模板鏈 3’端結(jié)合，形成部分雙鏈 DNA，即退火階段。
3． 延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫 72℃，耐熱 DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板，在引物
的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的 4 種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按 5’到 3’方向復(fù)制出互補(bǔ) DNA，即引物的延伸階段。
上述 3 步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸 3 個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過(guò)
一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò) 25～30 個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增 106～109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成
的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。
【儀器、材料、試劑】
(一) 儀器材料
1．PCR 熱循環(huán)儀
2．電泳凝膠成像系統(tǒng)
3．高速離心機(jī)
4．Tip 頭、離心管
(二) 試劑
1．DNA模板（自己提取 DNA）
2．4種 dNTP
3. 引物 1、引物 2
4. Taq 酶
5. 瓊脂糖
6. DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物
7. 三蒸水
【實(shí)驗(yàn)步驟】
（一）PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系 25 μL, 在無(wú)菌的0.2 mL 離心管中按下列操作程序加樣：
1．按下列次序加入下列各組成分：【這一步用的儀器及材料有移液器（含吸頭）、EP管】
反應(yīng)物 體積/μL
ddH2O 17.3
10 x Buffer 2.5                 
25 mmol/L MgCl2 2.0 
10 mmol/L dNTP 0.5 
10 μM 上游引物 1 0.4 μmol/L
10 μM 下游引物 1 0.4 μmol/L
DNA Taq 聚合酶 0.2   2. 用手指輕彈管底，使溶液混勻
3. 高速離心機(jī)瞬時(shí)離心，使溶液集中于管底【離心機(jī)】
(二) PCR 循環(huán)程序【PCR儀】
按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增:
 94℃ 預(yù)變性 3min
 94℃ 變性 30s
 50℃ 退火 40s   40cycle
 72℃ 延伸 1min
72℃ 充分延伸 5min
（三）PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)
1．配制 1.0% 瓊脂糖凝膠 【高壓蒸汽滅菌器、電子天平、制膠板、插樣梳、錐形瓶、微波爐或電爐】                                                   
2．4μl PCR產(chǎn)物上樣 【移液器】                           
3．5-8V/cm的電壓電泳【電泳槽、電泳儀】
4．電泳結(jié)束后，EB 染色20min 【移液器】
5．凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照分析結(jié)果【凝膠成像系統(tǒng)】
【注意事項(xiàng)】
1. 隔離操作區(qū)，分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。
2. 加樣完成后要瞬時(shí)離心，保證樣品沉于管底。
3. 加樣順序合理化，避免交叉污染。