藥物引發(fā)的肝毒性是造成肝損傷和急性肝衰竭的重要原因之一。因此如何高效的檢測(cè)藥物的有效性和安全性對(duì)于促進(jìn)藥物研發(fā)和減少藥物消耗至關(guān)重要。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的肝細(xì)胞具有典型的成熟細(xì)胞的特征和代謝形式，這對(duì)于我們用高內(nèi)涵篩選藥物是非常理想的。

雖然對(duì)于如何利用高內(nèi)涵進(jìn)行藥物篩選已經(jīng)有了很多標(biāo)準(zhǔn)的程序，但是對(duì)于如何通過(guò)圖像分析評(píng)估不同毒性卻仍非常復(fù)雜且大多依靠經(jīng)驗(yàn)。本文中我們闡述了如何利用 ImageXpress® Micro系統(tǒng)對(duì)多參數(shù)肝毒性進(jìn)行分析。每一個(gè)孔或者細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生 種化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，而這些反應(yīng)可以 用MetaXpress® 軟件的自定義模塊進(jìn)行分析。

優(yōu)勢(shì) ：

簡(jiǎn)易快速的對(duì)96或 384孔板進(jìn)行肝毒性篩選

在同一實(shí)驗(yàn)中得到多種肝毒性相關(guān)參數(shù)

利用用戶自定義參數(shù)分析，量身定制，結(jié)果更準(zhǔn)確

從標(biāo)準(zhǔn)活性檢測(cè)中獲得更多信息

細(xì)胞活性染料(例如Calcein AM)可以用來(lái)檢測(cè)活細(xì)胞中的化合物毒性。首先用各種化合物對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行72小時(shí)處理并染色。通過(guò) ImageXpress Micro系統(tǒng)的10倍物鏡可以得到肝細(xì)胞的圖像，然后我們用 MetaXpress軟件的Multi-Wavelength Cell Scoring應(yīng)用模塊對(duì)活細(xì)胞的整個(gè)核區(qū)域 (Hoechst復(fù)染色)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(Calcein AM)進(jìn)行分析(圖1)。

圖1 活細(xì)胞染色比單獨(dú)細(xì)胞計(jì)數(shù)提供更準(zhǔn)確的毒性信息。Multi-Wavelength Cell Scoring應(yīng)用模塊對(duì)活細(xì)胞Calcein AM染色進(jìn)行分析。右圖中綠色蒙板標(biāo)記出活細(xì)胞的核，灰色為死細(xì)胞的核。雖然陰性組和處理組的細(xì)胞核數(shù)相近，但是從活細(xì)胞百分比可看出處理藥物 Amiodarone毒性很強(qiáng)。另外，從細(xì)胞質(zhì)的染色中還可分析細(xì)胞面積、熒光強(qiáng)度等，研究化合物的毒理機(jī)制。

線粒體毒性的單染分析

線粒體去極化是缺氧損傷和氧化應(yīng)激的早期標(biāo)志。我們可以用JC-10對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，在完整的線粒體中，橙色的J-aggregates肉眼可見(jiàn)， 但是對(duì)于膜去極化來(lái)說(shuō)，這種染料可以滲入到細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)出特定的熒光波長(zhǎng)。在用ImageXpress Micro系統(tǒng)成像前先用化合物處理肝細(xì)胞60分鐘并用JC-10染色。系統(tǒng)的自定義模塊可以對(duì)健康線粒體中保存的染料和滲透到細(xì)胞質(zhì)中的染料分別定量。通過(guò)分析這兩類熒光染色信號(hào)強(qiáng)度的比率我們可以得到比之前單一檢測(cè)更可靠的數(shù)據(jù)(圖2)。

圖2  Valinomycin改變線粒體膜電位。肝細(xì)胞加Valinomycin處理60分鐘?；罴?xì)胞被JC-10著色并用10 倍鏡拍攝。上：綠色細(xì)胞質(zhì)和紅色線粒體的疊加圖。下：經(jīng)用戶自定義分析的結(jié)果蒙板圖，識(shí)別出來(lái)的線粒體的數(shù)量與化合物濃度相關(guān)。

磷脂質(zhì)病和脂肪變性是常見(jiàn)的肝細(xì)胞毒性標(biāo)志

一些藥物會(huì)引起磷脂質(zhì)病和脂肪變性，這是由脂肪代謝紊亂引起的組織中過(guò)多的磷脂質(zhì)和中性脂 肪聚集造成的。我們可以用成像的方法對(duì)肝細(xì)胞中的磷脂質(zhì)和中性脂肪的分布進(jìn)行檢測(cè)，這一檢測(cè)可以定位到單細(xì)胞水平。圖3我們列舉的實(shí)驗(yàn)中肝細(xì)胞被種在384孔板中，孵育了4天，然后用待測(cè)化合物處理24小時(shí)。

圖3 化合物處理造成的磷脂質(zhì)病和脂肪變性。肝細(xì)胞的磷脂(上)和中性脂肪(下)染色，10倍鏡獲取圖片。化合物處理的細(xì)胞脂質(zhì)染色呈陽(yáng)性(右)說(shuō)明了化合物毒性的特殊機(jī)制。

從毒性分析中獲得更多信息

 MetaXpress軟件中的自定義模塊編輯器可以讓科學(xué)家們針對(duì)自己感興趣的參數(shù)進(jìn)行復(fù)雜的分 析。這種自定義模塊已被證明可以有效的定量細(xì)胞大小或形狀，活細(xì)胞總數(shù)以及凋亡情況(圖 4)。這些模塊也可以應(yīng)用在圖像處理上，還可以用MetaXpress®PowerCore™ High Content Distributed Image Analysis Software對(duì)大量樣本進(jìn)行高通量篩選分析。

圖4 多參數(shù)肝毒性評(píng)價(jià)。用戶自定義模塊例子，分析了化合物處理后細(xì)胞面積、凋亡發(fā)生率和活細(xì)胞數(shù)。

多參數(shù)肝細(xì)胞毒性篩選的完整解決方案

多參數(shù)圖像分析可以顯著的提高分析的靈敏性，并且為我們進(jìn)一步了 化合物毒性發(fā)生機(jī)制提供 更多有價(jià)值的信息。利用MetaXpress 軟件的自定義模塊編輯器，科學(xué)家們可以自由的設(shè)計(jì)和調(diào)整圖像分析模塊并迅速的對(duì)毒性進(jìn)行分析及得到相應(yīng)結(jié)果。Molecular Devices為評(píng)估肝細(xì)胞毒性提供了靈活的的高內(nèi)涵篩選方案，這種方法遠(yuǎn)好于于傳統(tǒng)的非死即活的簡(jiǎn)單檢測(cè)。