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直接對生物樣品代謝組快速分析的工具：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜儀
LTQ-Orbitrap組合質(zhì)譜作為一個快速分析工具可以對直接注入的生物樣品的代謝組進(jìn)行研究。這個理念的一個有利的證據(jù)是通過流動注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中，整個實驗采樣時間只有3分鐘。一張典型的質(zhì)譜圖有幾千個質(zhì)荷比信號，其中400個是與分析相關(guān)的(即：在相同試驗條件下，他們的信號強(qiáng)度比背景噪聲高3倍以上且至少有60%獲取的輪廓圖與之相關(guān))。該方法對基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗證。Orbitrap質(zhì)譜的質(zhì)量測量可以區(qū)分同重的離子，而且可以對感興趣的離子進(jìn)行元素組成進(jìn)行分析和鑒定且質(zhì)量誤差在5ppm以下。通過線性離子阱的多級質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)譜對子離子的質(zhì)量測定，可以推測可能結(jié)構(gòu)。當(dāng)我們將該方法用于鎘的毒性研究時，它與zui初開發(fā)用于目標(biāo)分析的液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜方法取得了相同的效果。用多元統(tǒng)計分析也得到了相同的代謝指紋圖譜。該結(jié)果表明在鎘存在的情況下氨基酸的代謝發(fā)生了改變，增加了谷胱甘肽的合成。
因為飛行時間質(zhì)譜和四級桿-飛行時間質(zhì)譜具有很高的掃描速率，所以他們也非常適合對樣品進(jìn)行全面分析。在內(nèi)標(biāo)校正下能得到質(zhì)量數(shù)小于5ppm的高分辨率。在質(zhì)量分辨率8000-12000可以將同重離子分開。 (m/¢m， FWHM，即zui大半峰寬)。
雖然通過減少離子抑制和通過保留時間，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，二級質(zhì)譜圖對化合物鑒定是有用的，但是色譜分離影響被分析代謝指紋圖譜的信息量，因為缺少任何一種固定相可以對代謝組中具有多樣性的化學(xué)組分實現(xiàn)*分離。結(jié)果，至少需要兩個色譜分析系統(tǒng)用于研究整個代謝組譜圖。 此外，在多變量和單變量的數(shù)據(jù)分析方法學(xué)(背景噪聲抑制和色譜峰調(diào)整比對) 之前的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理仍然存在問題。一些分析相關(guān)的質(zhì)荷比信號會被排除，在對背景噪音消除過程中和對保留時間漂移的的校正時可能產(chǎn)生人為的假象。在本文中，在沒有任何前期的色譜分離步驟將生物樣品直接注入質(zhì)譜儀里對代謝組研究將是一個具有吸引力的選擇。
雖然直接注射質(zhì)譜分析(DIMS)已經(jīng)用低分辨質(zhì)譜或飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行了研究，但是超高質(zhì)量分辨率儀器例如傅立葉變換離子回旋共振(FTICR)質(zhì)譜儀是上述方法的又一選擇。通過在質(zhì)譜圖上的質(zhì)量數(shù)（亞ppm級的誤差）可以提供低分子量物質(zhì)(即分子量在1000以下)的元素組成，這無疑可以區(qū)分同重離子。盡管具有相似質(zhì)量數(shù)代謝物不能被區(qū)分的，但可以通過色譜分離實現(xiàn)辨別。也可以用各種活化模式進(jìn)行多級質(zhì)譜分析來實現(xiàn)分辨。如對于荷正電的單電荷和多電荷可用持續(xù)失諧衰減輻射碰撞誘導(dǎo)解離和紅外多光子裂解，對于帶多質(zhì)子離子進(jìn)行電子捕獲裂解和電子轉(zhuǎn)移解離裂解，對于帶多個負(fù)電的離子用EDD進(jìn)行裂解。實現(xiàn)對子離子的質(zhì)荷比進(jìn)行準(zhǔn)確測定。然而，由于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR)在高強(qiáng)磁場下和昂貴費用才能運轉(zhuǎn)，而且常需要長時間優(yōu)化，故目前沒有普遍使用。如今，這個問題被zui近出現(xiàn)的超高分辨率LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜所解決。 該設(shè)備的前面部分是一個線性離子阱(二維離子阱)，它能記錄一級質(zhì)譜和來自前提離子選擇的多級質(zhì)譜圖。與傳統(tǒng)的三維離子肼相比，線性離子肼能提供更好的動態(tài)范圍，較低的低質(zhì)量截止點，以及由于電子云分布在軸上而不是三維中心上故有較低的空間電荷效應(yīng)，因此提高了靈敏度。離子在被注入到Orbitrap質(zhì)量分析器中首先被C肼短暫累積。離子不是通過錘型磁場捕捉，而是儲存在由軸式中心電極和共軸外電極形成的靜電場。通過傅里葉變換過程得到不同質(zhì)荷比離子的震蕩頻率，可以準(zhǔn)確讀取質(zhì)荷比。Orbitrap質(zhì)量分析器得到的瞬時信號與中心電極軸運動有關(guān)，是由于傅里葉回旋共振儀器的輻射回旋運動引起的。本文的研究目的是在質(zhì)譜檢測前沒有任何色譜系統(tǒng)分離的情況下，用LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜快速對代謝指紋圖譜構(gòu)建進(jìn)行評價。目前為止, 這個理念的一個有利的證據(jù)是對酵母細(xì)胞提取物進(jìn)行了研究。通過流動注射進(jìn)樣，基于直接進(jìn)樣的方法，我們發(fā)展了該方法并進(jìn)行了驗證。同時，報道了代謝物鑒定的方法。然后將該方法應(yīng)用于受鎘毒害情況下酵母的代謝反應(yīng)。在*種目標(biāo)分析方式下，從代謝指紋圖譜中提取生物相關(guān)的離子，并與三重四級桿質(zhì)譜儀的結(jié)果進(jìn)行比對。在全局代謝組分析方式下，通過多變量統(tǒng)計分析得到相同的代謝指紋圖譜。
結(jié)論：
我們發(fā)展了能夠快速對代謝組指紋圖譜的一個新方法。它基于將生物樣品直接注入一臺新型雜交質(zhì)譜儀：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜。這個理念的一個有利的證據(jù)是通過流動注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中。在Orbitrap質(zhì)譜儀中的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)可以分辨同重離子，可以給出目標(biāo)離子和子離子的元素組成且誤差范圍小于5ppm。通過線性離子肼的多級質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)量分析器對子離子準(zhǔn)確質(zhì)量的測定可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測，雖然缺乏色譜分離而且是在低分辨的線性離子肼內(nèi)對母離子進(jìn)行選擇，但是本研究表明有可能通過子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測量分辨出同重離子，有可能通過裂解方式不同區(qū)分同分異構(gòu)體。
該方法對基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗證。 雖然方法的靈敏度受基質(zhì)效應(yīng)的影響，卻是色譜方法的一種有競爭力的選擇，色譜方法有費時，耐用性不好，需要批間比對和數(shù)據(jù)處理等諸多缺點（即背景噪音抑制，不同色譜圖保留時間漂移的校正）
當(dāng)研究鎘對酵母毒性時，雖然液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜的精密度比DIMS更高，但是DIMS能得到與液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜相似的結(jié)果。雖然DIMS不如液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜靈敏，但是卻能檢測大多數(shù)代謝物。同一代謝指紋圖譜進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析，突出顯示了在鎘存在下氨基酸庫發(fā)生修飾，谷胱甘肽合成增加。
綜上所述，該結(jié)果說明LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜質(zhì)量分析器能夠發(fā)揮多面手的能力，對同一代謝指紋圖譜既可以做目標(biāo)分析又可做全面分析。zui后，由于LTQ的高靈敏度和Orbitrap質(zhì)量分析器的準(zhǔn)確質(zhì)量測量和寬動態(tài)范圍，有可能在幾分鐘內(nèi)獲得復(fù)雜和具有豐富信息的代謝指紋圖譜，通過手工提取目標(biāo)分子的質(zhì)荷比信號或者通過統(tǒng)計學(xué)工具可分別進(jìn)行目標(biāo)和全局分析。
因為飛行時間質(zhì)譜和四級桿-飛行時間質(zhì)譜具有很高的掃描速率，所以他們也非常適合對樣品進(jìn)行全面分析。在內(nèi)標(biāo)校正下能得到質(zhì)量數(shù)小于5ppm的高分辨率。在質(zhì)量分辨率8000-12000可以將同重離子分開。 (m/¢m， FWHM，即zui大半峰寬)。
雖然通過減少離子抑制和通過保留時間，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，二級質(zhì)譜圖對化合物鑒定是有用的，但是色譜分離影響被分析代謝指紋圖譜的信息量，因為缺少任何一種固定相可以對代謝組中具有多樣性的化學(xué)組分實現(xiàn)*分離。結(jié)果，至少需要兩個色譜分析系統(tǒng)用于研究整個代謝組譜圖。 此外，在多變量和單變量的數(shù)據(jù)分析方法學(xué)(背景噪聲抑制和色譜峰調(diào)整比對) 之前的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理仍然存在問題。一些分析相關(guān)的質(zhì)荷比信號會被排除，在對背景噪音消除過程中和對保留時間漂移的的校正時可能產(chǎn)生人為的假象。在本文中，在沒有任何前期的色譜分離步驟將生物樣品直接注入質(zhì)譜儀里對代謝組研究將是一個具有吸引力的選擇。
雖然直接注射質(zhì)譜分析(DIMS)已經(jīng)用低分辨質(zhì)譜或飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行了研究，但是超高質(zhì)量分辨率儀器例如傅立葉變換離子回旋共振(FTICR)質(zhì)譜儀是上述方法的又一選擇。通過在質(zhì)譜圖上的質(zhì)量數(shù)（亞ppm級的誤差）可以提供低分子量物質(zhì)(即分子量在1000以下)的元素組成，這無疑可以區(qū)分同重離子。盡管具有相似質(zhì)量數(shù)代謝物不能被區(qū)分的，但可以通過色譜分離實現(xiàn)辨別。也可以用各種活化模式進(jìn)行多級質(zhì)譜分析來實現(xiàn)分辨。如對于荷正電的單電荷和多電荷可用持續(xù)失諧衰減輻射碰撞誘導(dǎo)解離和紅外多光子裂解，對于帶多質(zhì)子離子進(jìn)行電子捕獲裂解和電子轉(zhuǎn)移解離裂解，對于帶多個負(fù)電的離子用EDD進(jìn)行裂解。實現(xiàn)對子離子的質(zhì)荷比進(jìn)行準(zhǔn)確測定。然而，由于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR)在高強(qiáng)磁場下和昂貴費用才能運轉(zhuǎn)，而且常需要長時間優(yōu)化，故目前沒有普遍使用。如今，這個問題被zui近出現(xiàn)的超高分辨率LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜所解決。 該設(shè)備的前面部分是一個線性離子阱(二維離子阱)，它能記錄一級質(zhì)譜和來自前提離子選擇的多級質(zhì)譜圖。與傳統(tǒng)的三維離子肼相比，線性離子肼能提供更好的動態(tài)范圍，較低的低質(zhì)量截止點，以及由于電子云分布在軸上而不是三維中心上故有較低的空間電荷效應(yīng)，因此提高了靈敏度。離子在被注入到Orbitrap質(zhì)量分析器中首先被C肼短暫累積。離子不是通過錘型磁場捕捉，而是儲存在由軸式中心電極和共軸外電極形成的靜電場。通過傅里葉變換過程得到不同質(zhì)荷比離子的震蕩頻率，可以準(zhǔn)確讀取質(zhì)荷比。Orbitrap質(zhì)量分析器得到的瞬時信號與中心電極軸運動有關(guān)，是由于傅里葉回旋共振儀器的輻射回旋運動引起的。本文的研究目的是在質(zhì)譜檢測前沒有任何色譜系統(tǒng)分離的情況下，用LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜快速對代謝指紋圖譜構(gòu)建進(jìn)行評價。目前為止, 這個理念的一個有利的證據(jù)是對酵母細(xì)胞提取物進(jìn)行了研究。通過流動注射進(jìn)樣，基于直接進(jìn)樣的方法，我們發(fā)展了該方法并進(jìn)行了驗證。同時，報道了代謝物鑒定的方法。然后將該方法應(yīng)用于受鎘毒害情況下酵母的代謝反應(yīng)。在*種目標(biāo)分析方式下，從代謝指紋圖譜中提取生物相關(guān)的離子，并與三重四級桿質(zhì)譜儀的結(jié)果進(jìn)行比對。在全局代謝組分析方式下，通過多變量統(tǒng)計分析得到相同的代謝指紋圖譜。
結(jié)論：
我們發(fā)展了能夠快速對代謝組指紋圖譜的一個新方法。它基于將生物樣品直接注入一臺新型雜交質(zhì)譜儀：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜。這個理念的一個有利的證據(jù)是通過流動注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中。在Orbitrap質(zhì)譜儀中的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)可以分辨同重離子，可以給出目標(biāo)離子和子離子的元素組成且誤差范圍小于5ppm。通過線性離子肼的多級質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)量分析器對子離子準(zhǔn)確質(zhì)量的測定可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測，雖然缺乏色譜分離而且是在低分辨的線性離子肼內(nèi)對母離子進(jìn)行選擇，但是本研究表明有可能通過子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測量分辨出同重離子，有可能通過裂解方式不同區(qū)分同分異構(gòu)體。
該方法對基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗證。 雖然方法的靈敏度受基質(zhì)效應(yīng)的影響，卻是色譜方法的一種有競爭力的選擇，色譜方法有費時，耐用性不好，需要批間比對和數(shù)據(jù)處理等諸多缺點（即背景噪音抑制，不同色譜圖保留時間漂移的校正）
當(dāng)研究鎘對酵母毒性時，雖然液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜的精密度比DIMS更高，但是DIMS能得到與液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜相似的結(jié)果。雖然DIMS不如液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜靈敏，但是卻能檢測大多數(shù)代謝物。同一代謝指紋圖譜進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析，突出顯示了在鎘存在下氨基酸庫發(fā)生修飾，谷胱甘肽合成增加。
綜上所述，該結(jié)果說明LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜質(zhì)量分析器能夠發(fā)揮多面手的能力，對同一代謝指紋圖譜既可以做目標(biāo)分析又可做全面分析。zui后，由于LTQ的高靈敏度和Orbitrap質(zhì)量分析器的準(zhǔn)確質(zhì)量測量和寬動態(tài)范圍，有可能在幾分鐘內(nèi)獲得復(fù)雜和具有豐富信息的代謝指紋圖譜，通過手工提取目標(biāo)分子的質(zhì)荷比信號或者通過統(tǒng)計學(xué)工具可分別進(jìn)行目標(biāo)和全局分析。
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