由于co-IP相對問題較多，以co-IP為例進(jìn)行介紹。

 Step 1固定抗體

Step 2加樣

Step 3結(jié)合，去除非特異性蛋白

Step 4靶蛋白（紅色）洗脫或者互作蛋白復(fù)合物（紅色+黃色）洗脫

Step 5分析檢測—Western Blot或者質(zhì)譜

常用“黑話”

 上圖證明了EDR1和EDR4有相互作用。如果想要設(shè)計好實驗，讓我們先弄清以下“黑話”的意思吧。

陽性對照：證實細(xì)胞裂解物中確實存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白對（co-IP，比如誘餌蛋白X和靶蛋白Y），即為常說的input?？芍苯尤〕楹玫牡鞍兹芤哼M(jìn)行Western。

陰性對照：用來排除假陽性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白對都檢測到了，固然是值得高興的，但是這結(jié)果是不是假陽性呢？還得做個陰性對照。陰性對照如何設(shè)置呢？考慮到整個實驗體系會出現(xiàn)beads、抗X抗體、誘餌蛋白X、靶蛋白Y（co-IP）：

 *注意：總蛋白上樣量過多也會造成 非特異性結(jié)合，建議上樣量為500ug-1mg。上樣之前一定要先用BCA定個量！定個量！定個量！

pre-clear：上樣前先用裂解液過一遍柱子，減少基質(zhì)本身對蛋白的吸附。

Output：在某些co-IP實驗中，實驗人員會把IP后的上清分別進(jìn)行誘餌蛋白X和靶蛋白Y的WB檢測，該對照組稱為output組。

內(nèi)源性co-IP實驗，如果終結(jié)果為陽性，則可以證明兩個蛋白之間存在相互作用；但是結(jié)果為陰性，是否兩個蛋白就一定不發(fā)生相互作用了了呢？也不一定。有可能是兩個蛋白是弱相互作用力，這時候可能需要交聯(lián)劑協(xié)助，鎖定強(qiáng)化弱互作蛋白；也有可能是內(nèi)源蛋白表達(dá)量低，可先做過表達(dá)co-IP作為對照。

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