為什么多能干細(xì)胞大有前途？

      人類多能干細(xì)胞具有自我更新能力并且具有分化成為任何細(xì)胞類型的潛力，幫助克服現(xiàn)有動(dòng)物模型中對(duì)某些疾病的限制。雖然動(dòng)物模型長久以來被用于研究疾病的不同發(fā)育階段，但該類模型并不完美，比如，動(dòng)物模型心臟的尺寸以及靜息心率與人類有很大的差異，在一些情況下某些疾病的表型可能是無法準(zhǔn)確呈現(xiàn)。

        此外，病人來源的人類細(xì)胞的培養(yǎng)雖也逐漸被用于科學(xué)研究以及醫(yī)療發(fā)展。但是從病人血液或者組織中分離得到的這些細(xì)胞系很難持續(xù)的培養(yǎng)，同時(shí)特定的細(xì)胞系也很難從中分離得到。

        人類多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cells，PSCs）恰恰改變了以上困境。PSCs來源于正常的原代細(xì)胞，具有無限自我更新的能力，可通過誘導(dǎo)獲得特定的細(xì)胞類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）越來越多地被用于人類疾病模型的研究，為疾病模型的建立及其在藥物篩選中的應(yīng)用創(chuàng)造了新的可能性。此外，結(jié)合CRIPSR-Cas9等基因編輯技術(shù)，還能夠在iPSCs疾病模型中引入或糾正疾病相關(guān)的突變，從而研究突變對(duì)疾病表型的影響。

     基于iPSC構(gòu)建疾病模型的流程基于iPSC構(gòu)建疾病模型的步驟包括體細(xì)胞重編程為hiPSC、通過基因組編輯產(chǎn)生基因?qū)Γò▽?duì)照和突變的hiPSCs）、hiPSCs細(xì)胞系的克隆和鑒定、hiPSCs細(xì)胞系的分化以及疾病模型的可視化。

        基于iPSC構(gòu)建相關(guān)疾病模型及研究進(jìn)展帕金森癥是一種在中老年中常見的神經(jīng)退行性疾病，主要生理學(xué)癥狀是多巴胺能神經(jīng)元的丟失、α-突觸核蛋白的聚集、路易氏體的出現(xiàn)?，F(xiàn)有的帕金森癥治療僅針對(duì)疾病的癥狀，不能治愈或延緩病情發(fā)展。為尋找到更有效、確的靶點(diǎn)，一個(gè)全面且準(zhǔn)確的帕金森癥模型變得異常重要。一般而言，遺傳小鼠模型不能代表患者中觀察到的病理生理神經(jīng)退行性變和蛋白聚集模式。另一方面，局部或系統(tǒng)給予神經(jīng)毒素的帕金森癥動(dòng)物模型雖成功地復(fù)制了多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退行性變化，但它們不能以緩慢、漸進(jìn)的方式再現(xiàn)退行性病變，也不能形成在病人病理中出現(xiàn)的路易氏體。

       利用細(xì)胞重編程和基因編輯技術(shù)，可從患者體細(xì)胞中產(chǎn)生疾病特異性的iPSC，有助于了解功能相關(guān)性的分子發(fā)現(xiàn)和個(gè)人遺傳變異等。2020年The New England journal of Medicine雜志上發(fā)表文章題為《Personalized iPSC-Derived Dopamine Progenitor Cells for Parkinson's Disease》，報(bào)道了從自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的中腦多巴胺能祖細(xì)胞植入特發(fā)性帕金森病患者體內(nèi)產(chǎn)生的緩解帕金森癥的研究。

         患者特異性祖細(xì)胞是在良好的制造條件下產(chǎn)生的，并具有黑質(zhì)致密部神經(jīng)元的表型特性；在人源化小鼠模型的實(shí)驗(yàn)中表明，這些特異性的祖細(xì)胞缺乏免疫原性，當(dāng)被植入帕金森癥病患者的殼核，不需要進(jìn)行免疫抑制。帕金森癥的臨床癥狀在誘導(dǎo)的特異性祖細(xì)胞植入后18到24個(gè)月穩(wěn)定或改善。因此，利用iPSC在臨床方面緩解帕金森癥已經(jīng)初見曙光。

    誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的技術(shù)除了用于建立帕金森癥的模型之外，還在多種疾病的模型建立以及科學(xué)研究過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。比如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞模型可用于研究心肌細(xì)胞的功能和功能障礙、藥物篩選和毒性、以及心臟病新藥的開發(fā)。

除此之外，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞還廣泛用于建立表征不同3D結(jié)構(gòu)的組織和類器官（Organoid）。比如2013年Nature發(fā)表論文題為《Cerebral organoids model human brain development and microcephaly》，開發(fā)出了人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的衍生的3D器官培養(yǎng)系統(tǒng)，利用該類器官模型，研究人員使用RNA干擾和患者特異性誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來模擬小頭癥（Microcephaly）患者，是一種很難在小鼠身上進(jìn)行重現(xiàn)的疾病，并證明了患者器官樣體中神經(jīng)元的過早分化缺陷可以幫助解釋疾病的表型?？偟膩碚f，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在復(fù)雜的人體組織中衍生的三維類器官也能再現(xiàn)發(fā)育過程和疾病特征。

     但誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建立相關(guān)疾病模型也并非完美方案。如何將患者來源的細(xì)胞準(zhǔn)確分化為目標(biāo)細(xì)胞、如何建立背景類似的對(duì)照組、防止本身遺傳背景對(duì)于一些關(guān)鍵表型的掩蓋作用，以及重編程的效率和表觀遺傳的特征，都是研究者未來需要考慮的。沒有一項(xiàng)技術(shù)是完美的，但誘導(dǎo)多能干細(xì)胞模型的建立大大擴(kuò)展了我們精細(xì)模擬疾病發(fā)生發(fā)展的過程以及對(duì)藥物篩選和鑒定使用范圍，為未來開發(fā)相應(yīng)疾病的治療方案和臨床藥物提供了重要工具。

細(xì)胞重編程:

     該系統(tǒng)基于復(fù)制缺陷型仙臺(tái)病毒(SeV)的載體，安全且高效地導(dǎo)入并表達(dá)一些關(guān)鍵的遺傳基因，它們是將體細(xì)胞重編程為iPSC所必需的。多種細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)證，如成纖維細(xì)胞、PBMCs、CD34+細(xì)胞、T細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、尿細(xì)胞、羊水細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞等。此外，CTS™ CytoTune-iPS 2.1 仙臺(tái)病毒重編程試劑盒—無縫轉(zhuǎn)移至臨床培養(yǎng)。

細(xì)胞改造： 

       使用Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)進(jìn)行電穿孔或使用Invitrogen Lipofectamine 干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，將編輯工具遞送到iPSC中。雖然這兩種方法都能成功完成基因組編輯，但電穿孔遞送基因編輯工具通常編輯效率更高。

 細(xì)胞培養(yǎng)：

 單細(xì)胞分選hiPSC需要穩(wěn)定的培養(yǎng)基，既可培養(yǎng)單個(gè)hiPSC且適用于hiPSC擴(kuò)增培養(yǎng)，同時(shí)無需每天換液。

 細(xì)胞鑒定：

       畸胎瘤形成是證明hiPSC細(xì)胞系多能性的方法之一，但這一過程過于漫長且需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)。在基因表達(dá)分析中使用從hiPSC和擬胚體（一種從hiPSC產(chǎn)生所有三個(gè)胚層的無偏差方法）分離的mRNA，可通過檢測hiPSC中是否存在多能性基因及擬胚體中是否存在胚層基因，驗(yàn)證多能性。除此之外，您也選擇使用PluriTest檢測和KaryoStat檢測。

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