原代人類肝細(xì)胞(PHH)體外培養(yǎng)模型人類肝臟功能，可以產(chǎn)生與真實(shí)體內(nèi)藥物代謝非常相似的代謝譜。而PHH培養(yǎng)是研究體外肝細(xì)胞生物學(xué)、肝功能和藥物誘導(dǎo)肝毒性的金標(biāo)準(zhǔn)，但常規(guī)的2D水平 PHH培養(yǎng)由于受到去分化和肝特異性功能迅速喪失的限制，所以我們需要尋求一種更穩(wěn)定的體外模型構(gòu)建方法，從而能夠真實(shí)反映體內(nèi)肝臟結(jié)構(gòu)及功能，并具有更好的有效培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。

研究PHH細(xì)胞球模型在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、白蛋白分泌、CYP3A4活性分析、包括是否可以維持肝細(xì)胞特異性功能如ATP合成等方面進(jìn)行了綜合分析，數(shù)據(jù)均表明其在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)期間是穩(wěn)定的。另外在第5、7、14和第21天的基因表達(dá)譜分析中，白蛋白和CYP3A4等肝細(xì)胞特異性基因的表達(dá)量均高于2D培養(yǎng)組。在此基礎(chǔ)上，通過兩種藥物完成了藥物誘導(dǎo)毒性的肝損傷模型建立和相關(guān)功能驗(yàn)證。

這些結(jié)果表明，PHH 3D模型系統(tǒng)是一種很有前途的體外肝功能評(píng)估體系作，為我們未來工作的一部分，研究項(xiàng)目正在積j引入非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞和從星型細(xì)胞構(gòu)建3D模型，以評(píng)估和拓展各種肝臟疾病模型構(gòu)建的可行性。

圖1-A PHH 3D細(xì)胞球構(gòu)建流程（培養(yǎng)5天或者更少的時(shí)間趨于穩(wěn)定）

圖1-B PHH 3D細(xì)胞球模型在Nunclon™ Sphera 96孔U底板中呈現(xiàn)穩(wěn)定均一的狀態(tài)

圖2 PHH 3D 細(xì)胞球驗(yàn)證，右圖為構(gòu)建成功的3D模型

原代肝細(xì)胞球特點(diǎn)：

1- 穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)（2D培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)4~6天 vs 3D Spheroids 培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為數(shù)周）

2- 肝細(xì)胞球中CYP3A4活躍程度較高

3- 肝細(xì)胞球中蛋白及基因表達(dá)高度接近體內(nèi)表達(dá)水平

注：并不是所有的培養(yǎng)細(xì)胞均能成球形，需要進(jìn)一步驗(yàn)證

圖3 基于培養(yǎng)耗材的3D 模型驗(yàn)證

上圖分別對(duì)比了Nunc™Sphera™U型底96孔板和其它聚苯乙烯類培養(yǎng)容器，Nunc板材因其具有的超低細(xì)胞吸附力而促進(jìn)了細(xì)胞球以及類器官的長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)。

圖4-A PHH 3D細(xì)胞球相較2D培養(yǎng)，白蛋白及CYP3A4基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)一致性高表達(dá)

圖4-B PHH 3D細(xì)胞球相較2D培養(yǎng)，CYP3A4活性均呈現(xiàn)高水平

圖5 PHH 3D細(xì)胞球相較2D培養(yǎng)特異性敏感度較高，同時(shí)對(duì)兩種藥物毒性誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行分析，3D模型IC50分析更加接近于體內(nèi)代謝水平

圖6 肝內(nèi)膽管細(xì)胞球模型評(píng)估

通過Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7高內(nèi)涵平臺(tái)對(duì)培養(yǎng)14天的HepG2細(xì)胞球（左圖）和培養(yǎng)7天PHH細(xì)胞球（右圖）進(jìn)行高通量圖像采集及評(píng)估（CFDA\DAPI標(biāo)記，10x物鏡），PHH肝膽管細(xì)胞球模型呈現(xiàn)更加清晰的結(jié)構(gòu)。

圖7-A 細(xì)胞球大小及ATP產(chǎn)量與接種細(xì)胞數(shù)量成正比

（圖中顯示每孔接種1500個(gè)細(xì)胞的成球狀態(tài)更加均一和穩(wěn)定，約200µm的直徑）

圖7-B 上圖顯示細(xì)胞接種數(shù)量和ATP產(chǎn)量呈正比關(guān)系

本研究提供的數(shù)據(jù)明確顯示，經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)的PHH細(xì)胞球模型可以保持至少在21天內(nèi)表現(xiàn)為穩(wěn)定的形態(tài)維持、較高的活力和保持肝細(xì)胞特異性功能等特征。同時(shí)圖6也充分顯示肝膽管模型的成功構(gòu)建并且可以保持較好的肝細(xì)胞特異性功能和穩(wěn)態(tài)，且有持續(xù)的白蛋白表達(dá)。在充分驗(yàn)證PHH 3D細(xì)胞球可保持較高的活性基礎(chǔ)上，可以開展藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性研究，在保持較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)和優(yōu)化細(xì)胞用量的同時(shí)，更好地開展肝細(xì)胞功能的高通量藥物篩選和持續(xù)性研究。

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