蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定量方法以及進(jìn)展！

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)：蛋白質(zhì)定量方法早出現(xiàn)在20世紀(jì)50年代早期，當(dāng)時(shí)物理學(xué)家和化學(xué)家進(jìn)入生物學(xué)領(lǐng)域，并將他們的技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析和測(cè)量。 Lowry蛋白質(zhì)分析是個(gè)確定溶液中蛋白質(zhì)總水平的生化分析。不久之后，該測(cè)定通過(guò)其他測(cè)量方法引入，包括紫外（UV）系統(tǒng)和氨基酸分析。所有這些方法都能夠表征水中的蛋白質(zhì)或非常溫和的緩沖溶液。
 
隨著蛋白質(zhì)研究變得更加復(fù)雜，定量方法開(kāi)始發(fā)展。 1976年，布拉德福德分析是在天然溶液中研究更多蛋白質(zhì)并使用清潔劑或其他還原劑來(lái)保持蛋白質(zhì)可溶性的墊腳石。然后將Lowry試驗(yàn)再培養(yǎng)至二辛可寧酸（BCA）測(cè)定（也稱(chēng)為Smith測(cè)定），這使其更適合用于蛋白質(zhì)研究的溶劑中。

然而，蛋白質(zhì)定量的創(chuàng)新已存在超過(guò)25年。小編將概述當(dāng)前的蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量方法，并討論一種新的基于紅外的技術(shù)，用于快速準(zhǔn)確地測(cè)量痕量蛋白質(zhì)。

當(dāng)前現(xiàn)狀

用于蛋白質(zhì)和/或肽測(cè)定的一些的方法包括氨基酸分析，紫外（UV）光譜，比色測(cè)定，十二烷基硫酸鈉  -聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和光密度測(cè)定，基于免疫學(xué)的方法和質(zhì)譜法。

氨基酸分析

氨基酸分析測(cè)量蛋白質(zhì)中每種氨基酸的量，并被認(rèn)為是蛋白質(zhì)定量的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法可以檢測(cè)大多數(shù)氨基酸，檢測(cè)范圍為1 mg苯基硫代氨基甲?；≒TC）和5 mg至10 mg茚三酮。該方法不像其他測(cè)定那樣廣泛使用，因?yàn)樗嘿F，緩慢且需要技術(shù)專(zhuān)業(yè)知識(shí)。因此，氨基酸分析實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常被用作核心設(shè)施。

紫外光譜法

紫外光譜法測(cè)量樣品中芳香族氨基酸的吸光度，是用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量的方法?？梢詼y(cè)量任何類(lèi)型的蛋白質(zhì)，范圍從205nm處的1mg至100mg和280nm處的20mg至1,000mg。紫外分光光度計(jì)相對(duì)便宜且易于使用。

比色分析法

通過(guò)顯色試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的比色測(cè)定。見(jiàn)的比色測(cè)定是染料結(jié)合和熒光方法。熒光方法包括NanoOrange試劑盒（在570nm處10ng至10mg）和CBQCA（在550nm處10ng至150mg），其通常比染料結(jié)合方法更敏感，包括Bradford（1mg至50mg）和Bicinchoninic。 。酸（BCA； 0.2）。鎂至50毫克）。

大多數(shù)蛋白質(zhì)測(cè)定對(duì)溶劑條件敏感。有關(guān)套件和緩沖組件的更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)制造商的網(wǎng)站。該信息使研究人員能夠使用蛋白質(zhì)沉淀或小規(guī)模凝膠過(guò)濾去除潛在的干擾物質(zhì)。

SDS-PAGE和密度測(cè)定法

SDS是一種陰離子洗滌劑，可使蛋白質(zhì)線性化并用負(fù)電荷覆蓋它們。然后在電泳期間通過(guò)大小分離蛋白質(zhì)，并且可以使用定量光密度測(cè)定法測(cè)量蛋白質(zhì)。對(duì)于銀染色，SDS-PAGE蛋白質(zhì)測(cè)定范圍為每條1ng至5ng，對(duì)于考馬斯藍(lán)，SDS-PAGE蛋白質(zhì)測(cè)定范圍為每條40ng至50ng。

基于免疫學(xué)的方法

例如定量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA），Western印跡和斑點(diǎn)印跡，是用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和測(cè)量的非常常見(jiàn)且靈敏的測(cè)定，其依賴(lài)于使用抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)捕獲。這些方法中使用的抗體針對(duì)構(gòu)象和線性表位。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，重要的是使用針對(duì)肽或變性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體，因?yàn)镾DS使抗原變性。

質(zhì)譜法

質(zhì)譜法通常用于功能蛋白質(zhì)組學(xué)，以測(cè)量復(fù)雜生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)豐度的微小變化，以響應(yīng)疾病進(jìn)展或藥物治療等干擾。然而，質(zhì)譜法可能昂貴且緩慢，并且需要專(zhuān)業(yè)知識(shí)來(lái)運(yùn)行儀器。此外，質(zhì)譜儀可能無(wú)法*量化。

新穎的檢測(cè)方法

EMD Millipore提供基于直接檢測(cè)傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀的新蛋白質(zhì)/肽定量方法。該系統(tǒng)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)鏈中的酰胺鍵進(jìn)行高精度紅外（IR）測(cè)量，而不依賴(lài)于氨基酸組成，染料結(jié)合特性或氧化還原電位。

蛋白質(zhì)在IR光譜中由9個(gè)酰胺峰表示，并代表肽鍵的不同振動(dòng)模式。特別是，酰胺I和酰胺II鍵的*之處在于即使在復(fù)雜的混合物，還原劑和洗滌劑存在下它們的信號(hào)強(qiáng)度和純度也是相同的。因此，這些頻帶用于測(cè)量。該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性與氨基酸分析的準(zhǔn)確性相當(dāng)

直接檢測(cè)系統(tǒng)包括蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)和分析工具，包括預(yù)先安裝在軟件上的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。該測(cè)定僅需要2微升樣品，沉積在無(wú)測(cè)定卡上，置于儀器中然后測(cè)量。整個(gè)過(guò)程大約需要兩到三分鐘。

蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵組成部分。有多種方法可供選擇，每種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)，并且在為每種應(yīng)用選擇方法時(shí)需要考慮許多因素。

蛋白質(zhì)定量技術(shù)已經(jīng)使用了半個(gè)多世紀(jì)，但該領(lǐng)域相對(duì)停滯了超過(guò)25年。開(kāi)發(fā)新工具對(duì)于為研究人員提供快速，易用的蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量方法至關(guān)重要。