人原代牙周膜干細胞的背景與應用！

一、背景

人原代牙周膜干細胞來源于人的正常牙組織，牙周病是口腔疾病中的常見病和多發(fā)病，常導致牙周支持組織破壞或缺損。目前，牙周支持組織重建主要依賴機械、藥物或引導組織再生技術，隨著分子生物學、組織工程學和干細胞技術的飛速發(fā)展，牙周組織再生工程技術成為牙周病治療研究的熱點，牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cell，PDLSC）是牙周組織再生工程的關鍵種子細胞之一。因此，關于牙周膜干細胞的研究逐漸成為熱點。

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞,它包括胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞由于倫理學問題在臨床上的應用受到限制.成體干細胞通常以極少量的數(shù)量存在于局限的區(qū)域。從不同組織中分離成體干細胞目前尚無統(tǒng)一、理想的方法,主要是根據干細胞具有克隆形成能力的普遍特點和不同干細胞所*的生物、物理學特性進行分離和鑒定的。

骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓基質中的干細胞,是目前研究充分、應用泛的干細胞。已有研究表明,牙周膜中存在著干細胞,表達間充質干細胞的標記物Stro-1,并具有多向分化潛能,稱為牙周膜干細胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs),可作為牙周再生的種子細胞。干細胞在臨床治療中的應用越來越廣泛,研究表明,其增殖與分化是影響治療效果的關鍵因素。

干細胞的增殖和分化受多種內在機制和微環(huán)境因素的影響。微環(huán)境是影響干細胞移植治療效果、影響組織再生的重要因素。在組織再生的過程中經常會遇到因遭到嚴重破壞而發(fā)生炎性反應的過程。干細胞處于炎性微環(huán)境中,其增殖和分化的調控很可能受到炎性因子的影響。

二、應用

人原代牙周膜干細胞可用于TNF-α對牙周膜干細胞和骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化及骨創(chuàng)傷修復影響的研究：

炎性微環(huán)境中的炎性分子包括內源性的炎性介質(TNF-α,IL-1β,PGE2等)以及外源性分子(細菌脂多糖lipopolysaccharide,LPS,磨損顆粒particulate debris,機械張力或剪切力等)。其中TNF-α是目前*的重要的一個內源性誘生型促炎細胞因子,也是內毒素引起的感染性疾病直接關鍵的炎癥介質。TNF-α通過激活靶細胞內MAPKS與NF-κB通路使細胞發(fā)生增殖、分化、炎癥等應激反應。

NF-κB是一種廣泛存在于體內細胞的核轉錄因子,調節(jié)細胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子、免疫受體基因的表達,影響機體內的細胞分化、免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤生長等多種生物學功能?，F(xiàn)有研究結果顯示炎性因子能夠影響成骨細胞特異性基因的表達、細胞外基質的分泌以及成骨細胞的凋亡。然而,這些研究大都以鼠成骨細胞系為研究對象,并沒有說明干細胞向成骨細胞分化的過程中炎性信號通路的作用。因此,在組織再生過程中,慢性、長期、高濃度的炎性微環(huán)境對于成體干細胞增殖和分化的影響亟需深入的研究。

本研究采用免疫磁珠法分離PDLSCs和BMSCs,以不同濃度TNF-α刺激PDLSCs和BMSCs,探討TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化的影響；并對這種影響的信號通路進行了初步探討；同時進行體內實驗,觀察在BMSCs中阻斷NF-κB通路對于骨創(chuàng)傷愈合的影響,以期更好地了解炎癥刺激條件下成體干細胞的生物學特性以及基于成體干細胞的創(chuàng)傷修復過程,為臨床研發(fā)新的更有效的牙周治療方法開辟一條新思路。

TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化影響的研究組織塊法分離培養(yǎng)人原代牙周膜細胞,復蘇-80℃凍存的ST2細胞,傳代培養(yǎng),細胞生長狀態(tài)良好后用生物素標記的Stro-1抗體,免疫磁珠正選法分離PDLSCs和ST2細胞中BMSCs,免疫細胞化學染色和礦化誘導初步鑒定其干細胞特性；MTT法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖的影響；PNPP法檢測礦化誘導條件下不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs堿性磷酸酶活力的影響；實時定量PCR檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs成骨分化基因OSX,RUNX2,ALP,OC mRNA的影響；礦化結節(jié)茜素紅染色法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs礦化的影響。

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