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在您看到熒光定量PCR結(jié)果的時(shí)候是否也有過(guò)這樣的疑問(wèn)？隱隱約約感覺實(shí)驗(yàn)?zāi)硞€(gè)步驟出現(xiàn)問(wèn)題，卻又不知該從何下手。別擔(dān)心，有“對(duì)照精靈”們來(lái)助您一臂之力。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，從樣本采集到結(jié)果分析包含多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，針對(duì)不同的步驟，可以選擇不同的對(duì)照對(duì)流程進(jìn)行監(jiān)控（圖1）。

圖1. 實(shí)驗(yàn)流程和常見陰陽(yáng)性對(duì)照種類。

陰性樣本指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。從核酸提取開始做起，經(jīng)歷提取、逆轉(zhuǎn)錄（如有）和擴(kuò)增過(guò)程。如果出現(xiàn)擴(kuò)增，則說(shuō)明其中某一實(shí)驗(yàn)步驟中存在污染，結(jié)合NTC結(jié)果，可以判斷是否是樣本提取過(guò)程中引入的污染。

可使用含有擴(kuò)增片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控?zé)晒舛縋CR的體系是否正常，包括酶、引物、探針等。如果檢測(cè)中包含多個(gè)目標(biāo)片段，可以將這些目標(biāo)片段都克隆到同一個(gè)質(zhì)粒中，方便制備和使用。當(dāng)擴(kuò)增對(duì)照沒有擴(kuò)增，或者Ct值大于預(yù)期，則說(shuō)明定量PCR體系存在問(wèn)題。

表1：陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照和相關(guān)試劑盒

圖2：通過(guò)IPC提示體系中抑制劑的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為同樣濃度的RNA加入相同拷貝Xeno IPC，在不同濃度的擴(kuò)增抑制劑血紅素存在下（0-4μM），Xeno IPC的Ct值與目標(biāo)RNA的Ct值定量結(jié)果。

上面提到的陽(yáng)性對(duì)照能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)流程提供很多質(zhì)控信息。對(duì)于樣本本身的質(zhì)量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運(yùn)輸和保存過(guò)程中是否有嚴(yán)重的降解等問(wèn)題，則可以通過(guò)對(duì)內(nèi)參基因的定量來(lái)幫助回答。

內(nèi)參基因一般選擇在取樣組織或細(xì)胞中均有足量表達(dá)的基因，且其表達(dá)量不受環(huán)境、實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件和取樣時(shí)間等因素影響， 如管家基因（housekeeping gene）。常用人類內(nèi)參基因如表2所示。要注意沒有某個(gè)內(nèi)參基因是萬(wàn)能的，需要根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)處理方式進(jìn)行評(píng)估和選擇（可參考Application Note: Using TaqMan Endogenous Control Assays to select an endogenous control）。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)內(nèi)參基因的Ct值來(lái)判斷取樣和樣本降解情況。在相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因亦可用于對(duì)取樣量進(jìn)行均一化。

如果進(jìn)行的是單管多重實(shí)驗(yàn)，還需考慮內(nèi)參基因的表達(dá)量。當(dāng)內(nèi)參基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于目的基因時(shí)，內(nèi)參基因?qū)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增，體系中的原料消耗速度過(guò)快，造成目的基因擴(kuò)增效率降低。此時(shí)可以選擇引物濃度降低的TaqMan試劑盒（Primer-Limited）對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行測(cè)定。

表2：常用人類內(nèi)參基因試劑盒（cDNA）

對(duì)于核酸提取儀、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、超凈臺(tái)等可在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用70%的乙醇或者10%的次氯酸鈉（具腐蝕性，建議使用前咨詢?cè)O(shè)備供應(yīng)商）擦拭或者利用紫外線照射5-20分鐘進(jìn)行表面清潔。如果需要對(duì)殘留的核酸進(jìn)行更*的清潔， DNAZap™ PCR DNA Degradation Solutions能更有針對(duì)性地降解儀器和臺(tái)面上殘留的DNA和RNA。