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菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種菌種分為母種(一級(jí)種)、原種(二級(jí)種)和栽培種(三級(jí)種)三級(jí)。
工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩，挑選具有某種能力的有用菌種。分離就是首先是從土壤或腐生植物中收集含菌樣品，用無菌水稀釋后，涂布于置有適宜細(xì)菌、放線菌或霉菌生長的瓊脂培養(yǎng)基平皿上，并將其倒置于恒溫箱中，培養(yǎng)一定時(shí)間，平皿上長出的許多單個(gè)菌落(單一微生物的集落)經(jīng)分別分離后即為各種純種菌株，簡稱純種，移種至試管斜面培養(yǎng)基上，置4℃冰箱備用。
菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究。
1、梭氏法
將容有1滴細(xì)胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1、3帕?xí)r﹐將大試管密封保存。這是為減少細(xì)胞死亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)﹑緩慢脫水的干燥保藏法﹐適用于多種細(xì)菌﹑真菌。
2、冷凍真空干燥法
將細(xì)胞懸液每0、1~0、2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預(yù)凍1小時(shí)﹐再于-20~30℃﹑真空度為13、3帕的條件下脫水。在脫水過程后期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應(yīng)在3%以下。后﹐將安瓿瓶保持真空度1、3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細(xì)胞在凍結(jié)和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液。保護(hù)劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細(xì)菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的長期保存﹐是當(dāng)前保藏菌種的一個(gè)重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發(fā)光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。
3、液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法
用甘油或二甲亞(DMSO)作保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液﹐分裝入無菌安瓿瓶﹐每管0、2毫升﹐在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預(yù)凍至-40℃﹐然后立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存?；謴?fù)培養(yǎng)時(shí)﹐先直接侵入38℃水浴中解凍5~10分鐘﹐再種植于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。這是根據(jù)在低于-130℃時(shí)一切生化反應(yīng)處于停止?fàn)顟B(tài)﹑微生物也不能進(jìn)行代謝活動(dòng)而設(shè)計(jì)的凍結(jié)法。為避免凍死﹑凍傷和細(xì)胞內(nèi)形成大量冰晶﹐用保護(hù)劑制備懸液并控制預(yù)凍時(shí)的冷卻速率和解凍時(shí)融化速率。微生物的大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速解凍。此法適用于病毒﹑枝原體﹑各種細(xì)菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藍(lán)藻等。
4、定期移植法
將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上﹐在適溫度中培養(yǎng)﹐至靜止期或產(chǎn)生成熟的孢子時(shí)﹐置入5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養(yǎng)和保存的過程中﹐由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結(jié)果菌落群體中的個(gè)體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或1~4個(gè)月重新移植一次﹐具體間隔時(shí)間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備﹐但煩瑣﹐費(fèi)時(shí)﹐而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。
5、礦油封藏法
將化學(xué)純的液體石蠟(礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分﹐然后注入斜面培養(yǎng)物中﹐使液面高出斜面約1厘米。將試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐可以延長保藏的時(shí)間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛霉目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。
6、沙土管法
將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐可保存較長時(shí)期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。
7、麩皮法
將麩皮制成培養(yǎng)基﹐培養(yǎng)要保存的菌種﹐待生長良好后﹐置干燥器中保存。這是根據(jù)中國釀造酒﹑醋﹑醬時(shí)制曲的經(jīng)驗(yàn)所采用的一種保藏方法﹐適用于谷物微生物區(qū)系中的種類。
8、L-干燥法
又稱液體干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0、1M磷酸緩沖溶液(pH7、0)做分散媒﹐將待保藏的微生物制成高濃度的細(xì)胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0、05毫升﹔將安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫度為10℃﹐在13、3~1、3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)﹐用真實(shí)泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒﹑噬菌體﹑細(xì)菌﹑酵母菌﹑藍(lán)藻﹑原生動(dòng)物等。
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