前段時間小編給大家分享了WB/ELISA/IHC三大實驗的內(nèi)容，今天小編就來給大家簡要梳理一些WB流程中的一些細節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯而導(dǎo)致實驗重做。

做蛋白研究的小伙伴都知道，一個完整的Western Blot包括了很多個步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜、封閉，最后孵育一抗二抗后才能去進行檢測。時間跨度非常長，而且這中間的每一步都包含了很多的小細節(jié)，稍有不慎就會導(dǎo)致結(jié)果出錯，然后又得從頭來過。所以，關(guān)于WB，幾乎每一位經(jīng)驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。

一：樣品的獲取與制備

一般來說我們檢測的樣本主要為細胞或者組織，制備的過程中盡量保持低溫，其次在制備時一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。

二：配膠、上樣及蛋白電泳

配膠前將玻璃清洗干凈烘干（用紙巾擦干/有時間50°C烘干）。晾干后根據(jù)蛋白分子量進行不同濃度凝膠配制，上樣是需要把蛋白進行煮沸變性，如果進行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調(diào)制相同，電泳時低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍即將跑出膠面時終止電泳。

三：轉(zhuǎn)膜及封閉

膜的選擇主要從實驗?zāi)康暮蛯嶒炓髞砜紤]。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。

建議轉(zhuǎn)移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗滌膜，以便移除殘留的轉(zhuǎn)移緩沖液，隨后在室溫條件下含5% 脫脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污劑 (TBST)中封閉1小時。這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。應(yīng)避免膜封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。封閉后在TBST 中洗滌5分鐘。

四：抗體的孵育和檢測

抗體孵育：目的蛋白印跡在膜上，經(jīng)過封閉之后，印跡目的蛋白與一個或多個抗體孵育。第一個抗體（一抗）與目的蛋白結(jié)合，而第二個抗體（二抗）與第一個抗體結(jié)合，二抗本身結(jié)合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。不過有些一抗也具有直接標(biāo)記的功能，但使用標(biāo)記二抗有明顯優(yōu)勢。首先不止一個二抗分子能與單個一抗分子結(jié)合，形成信號；其次，標(biāo)記的二抗可用于大量不同特異性的一抗，因而無需標(biāo)記多個一抗。

直接western blot檢測方法：在直接檢測方法中，酶直接連接到一抗上。操作簡單，檢測步驟少。雖然直接檢測是快速和直接的，但它往往比間接檢測的靈敏度低，因為在這個過程中可以發(fā)生信號放大的步驟更少。此外，酶直接標(biāo)記到一抗上可能會造成成本和資源上的限制。

間接western blot檢測方法：間接檢測方法比直接檢測方法更受歡迎，主要是靈敏度更高。通過間接檢測，識別感興趣的抗原的抗體，稱為一抗，檢測是通過添加標(biāo)記的二抗實現(xiàn)的，二抗可以識別一抗上的特定表位。這種表位通常是種屬特異性的；例如，在兔體內(nèi)產(chǎn)生的幾種不同的一抗都可以被同一種抗兔二抗體所識別。