培養(yǎng)基的制備、融化程序的確認(rèn)及注意事項(xiàng)！

一、培養(yǎng)基的制備 

微生物實(shí)驗(yàn)室所用培養(yǎng)基可按藥典規(guī)定檢查方法中所列的培養(yǎng)基配方配制，也可使用復(fù)合型的干燥培養(yǎng)基，或是使用已配制且分裝好的成品培養(yǎng)基。干燥培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用不同的方法使水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚恚浞只靹?，使成干燥的粉末狀。用時(shí)只要按比例加入一定量的蒸餾水，經(jīng)過(guò)溶解、分裝、高壓蒸汽滅菌，即可應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省培養(yǎng)基配制時(shí)間，攜帶方便，使用簡(jiǎn)易，特別使用于一般流動(dòng)性及設(shè)備簡(jiǎn)單的小型實(shí)驗(yàn)室。目前，國(guó)內(nèi)外已有多家生產(chǎn)，如法國(guó)生物梅里埃公司、美國(guó)密理博公司的產(chǎn)品、中國(guó)藥品生物制品所監(jiān)制的產(chǎn)品，其制造方法有下列幾種：噴霧法、真空法、烘干法、蒸發(fā)法、球磨法。 

藥品微生物限度檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、抗生素效價(jià)測(cè)定、藥敏試驗(yàn)及其抗菌、防腐等項(xiàng)微生物檢測(cè)中，培養(yǎng)基的質(zhì)量好壞、穩(wěn)定與否，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有極為重要的影響。但因培養(yǎng)基的配方中各原料成分的理化性能、穩(wěn)定性不同，致使檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異，即使同一廠家生產(chǎn)的同一型號(hào)的原料產(chǎn)品，各個(gè)批號(hào)之間質(zhì)量都有較大的差異，加上各地實(shí)驗(yàn)室配制培養(yǎng)基的方法不一，同一實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)有顯著不同。為此培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分重要。干燥培養(yǎng)基，使用方便，節(jié)約人力、物力、時(shí)間，是培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)化的必由之路。按說(shuō)明書要求稱取適量后加水溶解配制，所用培養(yǎng)基質(zhì)量必須符合藥典規(guī)定的靈敏度檢查試驗(yàn)及無(wú)菌性檢查試驗(yàn)才可用于檢驗(yàn)。 

配制培養(yǎng)基、緩沖液、試劑等時(shí)，稱量要迅速以免吸潮而影響稱量的準(zhǔn)確性，同時(shí)為避免增加培養(yǎng)基等中的金屬離子及其他微量化學(xué)元素而影響微生物的生長(zhǎng)、鑒別、所用器具、容器應(yīng)為潔凈玻璃制品，所用溶解用水應(yīng)為純水或蒸餾水。加熱溶解時(shí)不斷攪拌促進(jìn)培養(yǎng)基充分溶解，采用直火加熱時(shí)易使培養(yǎng)基結(jié)底炭化而影響營(yíng)養(yǎng)度和澄明度，可用沸水浴或隔套蒸鍋通過(guò)蒸汽加熱。然后調(diào)節(jié)pH，按規(guī)定的要求分裝，容器封口后用經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的滅菌程序滅菌。滅菌程序的參數(shù)應(yīng)記錄于高壓滅菌柜的使用日志及相應(yīng)的配制記錄中。注意滅菌后物品應(yīng)有適當(dāng)措施防止再次污染。制備某些選擇性培養(yǎng)基或淋洗液需在使用前向培養(yǎng)基中加入β-內(nèi)酰胺酶等試劑時(shí)，務(wù)必確保所加入劑的無(wú)菌性和質(zhì)量保證。 

制備好的培養(yǎng)基、緩沖液等應(yīng)及時(shí)抽取適量用于檢查pH、無(wú)菌性、靈敏度等質(zhì)量是否符合規(guī)定。微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基、緩沖液及試劑的配制應(yīng)有原始記錄供追溯檢查。所有相關(guān)信息包括：名稱、處方原材料、稱量數(shù)、稀釋溶解量、滅菌條件、滅菌程序參數(shù)，制備日期、制備人簽名、質(zhì)量檢查結(jié)果等，都必須在原始記錄或工作日志上反映出來(lái)。 

二、培養(yǎng)基融化程序的確認(rèn) 

裝于試管瓶?jī)?nèi)的成品固體培養(yǎng)基，在使用前需將其融化。這一融化過(guò)程也同樣需要確認(rèn)，以保證培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不會(huì)因過(guò)度加熱而受影響。 

一般培養(yǎng)基應(yīng)只能進(jìn)行1次蒸汽滅菌處理，否則，重復(fù)高溫加熱會(huì)破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。因此，不宜使用蒸汽滅菌柜融化瓊脂培養(yǎng)基，宜選用沸水浴或微波爐融化培養(yǎng)基。因沸水浴的溫度始終控制在100℃以內(nèi)，相當(dāng)安全，但對(duì)裝量較大的培養(yǎng)基要使融化均勻充分，則加熱的時(shí)間較長(zhǎng)，微波爐融化培養(yǎng)基具有快速的優(yōu)點(diǎn)。 

至少選擇3批具有代表性的不同類型培養(yǎng)基，對(duì)其融化前后的質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比檢查。確認(rèn)時(shí)，應(yīng)對(duì)不同融化法的運(yùn)行參數(shù)（時(shí)間和溫度）予以明確設(shè)定，確認(rèn)合格后，將其寫入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中。如果一臺(tái)設(shè)備可以設(shè)定多個(gè)參數(shù)，建議在其和設(shè)定值下分別進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，以確定正常的使用范圍。有關(guān)抗生素效價(jià)分析用培養(yǎng)基的融化過(guò)程確認(rèn)方法，要參照有效期的確認(rèn)試驗(yàn)方法進(jìn)行。  

三、培養(yǎng)基制備應(yīng)注意事項(xiàng) 

1、常用玻璃儀器的準(zhǔn)備 

制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。 

（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。 

（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。 

（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用。 

2、培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存 

（1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。 

在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。 

（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H。因此測(cè)定pH是培養(yǎng)基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測(cè)定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2℃。調(diào)節(jié)pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會(huì)比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會(huì)比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。因此對(duì)培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測(cè)定，并記下每次pH的測(cè)定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對(duì)滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。干燥培養(yǎng)基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗(yàn)證。測(cè)定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過(guò)濾，使培養(yǎng)基澄清。 

（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn)。每次使用前后，均要對(duì)分配器的管道系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養(yǎng)基前，則要采用無(wú)菌硅膠管。 

固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。 

平皿：傾注平皿，應(yīng)在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min。讓水蒸汽自然蒸發(fā)。

斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染。 

高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。 

分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)）進(jìn)行滅菌處理。液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 

培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應(yīng)延長(zhǎng)至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細(xì)菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，*排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全部殺滅微生物。以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。 

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