陽性對照（Positive Control）是已知或*有目的蛋白表達(dá)的樣本。當(dāng)對一個靶標(biāo)并無檢測經(jīng)驗(yàn)時，在實(shí)驗(yàn)初期，強(qiáng)烈建議增加陽性對照幫助排查一系列問題，例如，待測樣本中該靶標(biāo)的表達(dá)量、操作步驟、抗體表現(xiàn)等。

而內(nèi)參蛋白如 β-actin, GAPDH 等，一般在樣本中高表達(dá)，作為管家蛋白而用來對比不同樣本間的上樣量 (Loading Control)，并非目的蛋白的陽性對照。

與陽性對照相對應(yīng)的，還有陰性對照，即不表達(dá)靶標(biāo)蛋白的樣本。如圖 1 所示，利用使用抑制劑或生長因子處理，制備針對 p-AKT(Ser473) 的陰性或陽性對照。

圖 1：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060（上）或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（下），對未經(jīng)處理或經(jīng) LY294002/Wortmannin 處理的 PC-3 細(xì)胞、經(jīng)血清饑餓或 PDGF 處理的 NIH/3T3 細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

a. 總蛋白的陽性對照

選用明確表達(dá)該蛋白的細(xì)胞或組織樣本；可參考說明書示例圖或數(shù)據(jù)庫。如下圖所示，Saos-2 細(xì)胞高表達(dá) RUNX2，適宜作為陽性對照樣本，而 LNCaP 細(xì)胞不表達(dá)該靶標(biāo)。

圖 2：使用 RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb #12556 和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457， 對 Saos-2 和 LNCaP 細(xì)胞的提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

b. 翻譯后修飾蛋白的陽性對照

并非所有的細(xì)胞都有基礎(chǔ)的翻譯后修飾水平（如磷酸化）的表達(dá)。如圖 3 所示，不同的細(xì)胞 p-AKT(Ser473) 的基礎(chǔ)水平差別非常大。有些靶標(biāo)需要合適的刺激條件（包括誘導(dǎo)因子、劑量和時間窗）使蛋白獲得修飾。您可查看說明書、陽性對照處理表，或者通過廣泛閱讀文獻(xiàn)，了解處理方式，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索條件。

圖 3：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb 檢測不同樣本中靶標(biāo)的表達(dá)。

圖 4：使用 Cell Fractionation Kit #9038，對 HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞組分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果表明蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞器/膜以及胞核/細(xì)胞骨架的定位。全細(xì)胞裂解物 (WCL) 表示總蛋白。細(xì)胞漿蛋白 (Cyto) 使用 CIB 緩沖液進(jìn)行分離。膜和細(xì)胞器蛋白 (Mem) 使用 MIB 緩沖液進(jìn)行分離。胞核和細(xì)胞骨架蛋白 (Nuc) 使用 CyNIB 緩沖液分離。

樣本裂解后，建議進(jìn)行超聲。超聲可以破壞膜結(jié)構(gòu)，斷裂 DNA，降低樣本的粘稠度，讓樣本更加均質(zhì)化，增加蛋白的溶解，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。對于核蛋白或者膜相關(guān)蛋白，超聲步驟尤為重要 (圖 5)。

超聲步驟為冰上 3 次  5 秒的超聲（50% 輸出功率），控制超聲探頭位置，避免產(chǎn)生氣泡。如沒有超聲儀，可用 1 mL 注射器針頭，冰上反復(fù)抽打裂解液 5~10 次，達(dá)到類似于超聲的效果。

圖 5：使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody#9701 對超聲或者未經(jīng)超聲處理的細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測

封閉的目的是減少由一抗或二抗的非特異性結(jié)合引起的背景。BSA 僅含有一種蛋白質(zhì)，分子量為 60KD。而奶粉則含有多種蛋白質(zhì)，所以封閉作用更佳（圖 6）。

有文章指出奶粉中的磷酸酶可影響磷酸化信號，那磷酸化蛋白還能用牛奶嗎？我們的回答：是的。二十余年的磷酸化蛋白抗體研發(fā)經(jīng)驗(yàn)告訴我們，新鮮配置的牛奶不會對磷酸化信號產(chǎn)生任何影響，但隨著牛奶儲存時間的延長（即便在 4 ℃），就可能使磷酸化信號下降。且牛奶封閉更加全面，使得磷酸化靶標(biāo)識別特異性更佳。

圖 6：使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP^® Rabbit mAb #13038，檢測經(jīng) PDGF 處理的 3T3 細(xì)胞樣本，BSA 封閉的結(jié)果中可見背景和雜帶，而牛奶封閉的結(jié)果背景更干凈，信號強(qiáng)且清晰。

封閉時使用 5% 脫脂奶粉-TBST，搖床上室溫封閉 1 h。如后續(xù)使用熒光發(fā)光法，則封閉時不可含有 Tween^® 20。二抗孵育時，也推薦用 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋二抗，降低背景。注意，需使用實(shí)驗(yàn)級脫脂奶粉（Nonfat Dry Milk #9999），食品級奶粉不可用于實(shí)驗(yàn)。