BBT電泳緩沖液（pH8.6）如何正確使用

上海信帆生物供應(yīng)BBT電泳緩沖液，可用于電泳實(shí)驗(yàn)，醋酸纖維素薄膜實(shí)驗(yàn)等，操作方便，質(zhì)量穩(wěn)定！

本公司用于的電泳緩沖液，離子強(qiáng)度為0.075.操作時(shí)候請(qǐng)注意上樣緩沖液：所有泳道應(yīng)使用相同的上樣緩沖液，以防止因離子強(qiáng)度不同造成條帶遷移率偏差。

醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

1.首先,裁剪適量尺寸濾紙條來(lái)搭建濾紙橋,再將緩沖液倒入電泳槽,在醋酸纖維素薄膜無(wú)光澤面做好點(diǎn)樣標(biāo)記。
2.然后,將該面在下浸入緩沖液約二十分鐘,在浸透*以后,取出吸取多余緩沖液的備用。
3.然后,用加樣器取適量蛋白樣品均勻加于點(diǎn)樣線處,最終形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。
4.然后,將點(diǎn)樣端位于負(fù)極,無(wú)光澤面朝下,平整放于濾紙橋上,平衡完畢后,調(diào)節(jié)電壓并開始電泳。

其他注意事項(xiàng)：

1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理
　　市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂浮15s—30s時(shí)，膜片吸水不均勻，則有白斑點(diǎn)或條紋，這提示膜片厚薄不勻，應(yīng)舍去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復(fù)。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復(fù)到原來(lái)多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染，取膜時(shí)，應(yīng)戴指套或用鑷子。
　　
2、緩沖液的選擇 　　
醋酸纖維素薄膜電泳常選用 BBT電泳緩沖液（pH8.6），其濃度為0.05mol/L—0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關(guān)。選擇時(shí)，先初步定下某一濃度，如電泳槽兩極之間的膜長(zhǎng)度為8 cm—10cm，則需電壓25V/cm膜長(zhǎng)，電流強(qiáng)度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳達(dá)不到或超過(guò)這個(gè)值時(shí)，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過(guò)低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，并由于擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過(guò)高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過(guò)于集中不易分辨。 　
　
3、加樣量
　　加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測(cè)手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測(cè)方法越靈敏，加樣量則越少，對(duì)分離更有利。如加樣量過(guò)大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費(fèi)時(shí)。如電泳后用洗脫法定量時(shí)，每厘米加樣線上需加樣品0.1μl—0.5μl約相當(dāng)于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時(shí)，每厘米加樣線加樣量不超過(guò)1μl，相當(dāng)于60μg—80μg的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時(shí)，加樣量則應(yīng)多些。對(duì)每種樣品加樣量均應(yīng)先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。
　　點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。 　　
4、電量的選擇
　　電泳過(guò)程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4mA/cm—0.5mA/cm寬膜為宜。電流強(qiáng)度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過(guò)低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散。
5、染色液的選擇
　　對(duì)醋酸纖維素薄膜電泳后染色應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是染料對(duì)被分離樣品有較強(qiáng)的著色力，背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素膜溶解。
　　應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色深不易脫去；時(shí)間短，著色淺不宜區(qū)分，或造成條帶染色不均，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。 　
　
6、透明及保存
　　透明液應(yīng)臨用前配制，以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前，薄膜應(yīng)*干燥。透明時(shí)間應(yīng)掌握好，如在透明乙液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)則薄膜溶解，太短則透明度不佳。
　　透明后的薄膜*干燥后才浸入石蠟中，使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟不易浸入，薄膜不易平展。宜。

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