產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特性與檢驗(yàn)方法！

一、行病學(xué)

產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎見(jiàn)的病原之一?？梢鸬湫偷氖澄镏卸?、爆發(fā)。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病為魏氏梭菌中毒?；颊吲R床特征是劇烈腹絞痛和腹瀉。攝食被本菌污染的食品后8�22小時(shí)開(kāi)始發(fā)病。在食品中該菌數(shù)量必須達(dá)到很高時(shí)（1.0×107或更多），才能在腸道中生產(chǎn)毒素，病程通常在24小時(shí)內(nèi)，但某些個(gè)體的不顯著癥狀可能會(huì)持續(xù)1�2周，已報(bào)導(dǎo)有少數(shù)病人因脫水和其它混合感染而導(dǎo)致死亡。

據(jù)美國(guó)人類衛(wèi)生教育福利部報(bào)導(dǎo)魏氏梭菌引起的食物中毒，在美國(guó)占細(xì)菌性食物中毒的30%左右，另?yè)?jù)美國(guó)疾病控制中心，估計(jì)每年因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬(wàn)人，其中大約只報(bào)導(dǎo)1200例，暴發(fā)約20起，大量的暴發(fā)和少量的發(fā)病都與公共飲食有關(guān)。例如：學(xué)校的自助食堂和護(hù)理病房，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒發(fā)生于兒童和老人。

產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境中，經(jīng)常在人和許多家養(yǎng)及野生動(dòng)物的腸道中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的芽胞長(zhǎng)期存在于土壤和沉淀物中，從牛肉、豬肉、羔羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜，燉肉和肉汁中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉類和魚(yú)類食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因?yàn)槭称芳訜岵?，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加溫不夠或后污染而在緩慢的冷卻過(guò)程中，細(xì)菌繁殖體大量繁殖并形成芽胞產(chǎn)生腸毒素，其食品并不一定在色味上發(fā)現(xiàn)明顯的變化，人們?cè)谡`食了這樣的熟肉或湯菜，就有可能發(fā)病。

產(chǎn)氣莢膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的熱抵抗力很強(qiáng)，由患者糞便中分離的芽胞能耐受100℃,1�5小時(shí)的加熱。除了具有形成芽胞及耐熱等特點(diǎn)之外，生化性狀，毒素及酶的特異性等，同其它魏氏梭菌是一致的。

當(dāng)產(chǎn)品達(dá)到合適溫度時(shí)，那些未被殺死的芽胞，由于蒸煮而使其可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過(guò)快速一致的冷卻。事實(shí)上在所有暴發(fā)的病例中，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒(méi)有經(jīng)過(guò)恰當(dāng)冷卻事先煮好的食品，特別當(dāng)做好的食品量又是很大時(shí)，適當(dāng)?shù)臒崽幚恚?0℃以上）充分的再加熱，冷卻食品（中心溫度為24℃）也是必要的控制措施，培訓(xùn)食品加工人員，仍是控制措施的一個(gè)關(guān)鍵方面。

二、生物學(xué)特性

1、形態(tài)

本菌菌體兩端鈍圓，直桿狀1-2×2-10μm，革蘭氏陽(yáng)性，卵圓形芽胞位于菌體或近端，不比菌體明顯膨大，但有些菌株在一般的培養(yǎng)條件下很難形成芽胞，無(wú)鞭毛，在人和動(dòng)物活體組織內(nèi)或在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)有可能形成莢膜。

2、培養(yǎng)

本菌雖屬厭氧性細(xì)菌，但對(duì)厭氧程度的要求并不太嚴(yán)，甚至在EH=200-250mv的環(huán)境內(nèi)也能生長(zhǎng)。

在普通培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，若加葡萄糖，血液，則生長(zhǎng)更好。生長(zhǎng)適宜溫度為37-47℃，多認(rèn)為43-47℃為最宜本菌生長(zhǎng)和繁殖速度極快，在適宜條件下增代時(shí)間僅8min，可利用高溫快速培養(yǎng)法，對(duì)本菌進(jìn)行選擇分離，如在45℃下，每培養(yǎng)3-4小時(shí)傳種1次，即可較易獲得純培養(yǎng)，在深層葡萄糖瓊脂中大量產(chǎn)氣，致使瓊脂破碎，在牛奶培養(yǎng)基中，可見(jiàn)到暴裂發(fā)酵，在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)即可見(jiàn)到生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵?，但不被消化?/span>

在普通瓊脂平板上培養(yǎng)15小時(shí)左右可見(jiàn)到菌落，培養(yǎng)24小時(shí)菌落直徑2�4mm，呈凸面狀，表面光滑半透明，正圓形，在營(yíng)養(yǎng)成分不足或瓊脂濃度高的平板上，有時(shí)尤其經(jīng)過(guò)傳種的菌株，可能形成鋸齒狀邊緣或帶放射狀條紋的R型菌落。

在含人血、兔血或綿羊血的瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落周圍有雙層溶血環(huán)，內(nèi)層溶血*，外層溶血不*，好似靶狀。

在乳糖、牛奶、卵黃瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落周圍出現(xiàn)乳光渾濁帶。此反應(yīng)能被本菌α抗毒素抑制。由于發(fā)酵乳糖菌落周圍的培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化（中性紅指示劑呈粉紅色）不消化牛奶，不分解游離脂肪，菌落周圍不出現(xiàn)透明環(huán)及虹彩層。

3、生化特性

所有菌株均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，但也有例外。能將亞硫酸鹽還原為硫化物。在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落。發(fā)酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固，同時(shí)由于大量產(chǎn)氣凝塊碎裂，所謂暴力發(fā)酵，這是本菌的主要生化特征之一，也是主要鑒別的指標(biāo)。G+C克分子百分比為24-27%。

4、毒素

(1)外毒素：各型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素(或可溶血抗原)共有12種,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素與人類食物中毒有關(guān)。

(2)腸毒素：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐熱株能引起人的食物中毒,關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒的發(fā)病機(jī)制,基本認(rèn)為是,被耐熱性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,雖經(jīng)烹制加熱,但芽胞不僅不死滅,反而由于受到〝熱刺激〞,在較高溫度長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存(即緩時(shí)冷卻)的過(guò)程中芽胞發(fā)芽,生長(zhǎng),繁殖,而且隨食物進(jìn)入人腸道的這些繁殖體容易再形成芽胞,同時(shí)產(chǎn)生腸毒素,聚集于芽胞內(nèi),當(dāng)菌體細(xì)胞自溶和芽胞游離時(shí)，腸毒素將被釋放出來(lái),人、猴、狗等口服人工提取的該腸毒素能引起腹瀉。

人和動(dòng)物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素的免疫主要表現(xiàn)為抗腸毒素的產(chǎn)生,健康者血清常含有抗腸毒素,似乎表明產(chǎn)氣莢膜梭菌作為正常菌群,在腸道內(nèi)可能在不斷地產(chǎn)生著腸毒素。

三、檢驗(yàn)方法

1、樣品的儲(chǔ)存和運(yùn)送

如樣品不能立即進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油--氯化鈉溶液(液體食品應(yīng)加雙料的),將樣品做低溫保存,直到檢驗(yàn),運(yùn)送樣品時(shí),應(yīng)使樣品保持冷凍狀態(tài),并要避免容器消損。

2、將解凍樣品取25g移入滅菌的均質(zhì)杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速攪拌1-2分鐘,使之均質(zhì)化,作為1:10稀釋液,以上1:10稀釋的均質(zhì)液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀釋液,(如為液體樣品則可吸取25mL加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋并搖勻,再作10倍遞增稀釋即可)。

傾注不含卵黃的TSC瓊脂倒10個(gè)滅菌平皿中,每皿約5mL,并迅速旋轉(zhuǎn)平皿,使瓊脂凝固后,將每個(gè)平皿編號(hào)標(biāo)記,以無(wú)菌操作,吸取稀釋樣品1mL分別加到每個(gè)瓊脂平板表面中心,再向平皿傾注不含卵黃的TSC瓊脂15mL,緩慢地旋轉(zhuǎn)平皿,使其與接種物混合均勻.也可用滅菌L棒,將0.1mL樣品稀釋液均勻地涂布于不含卵黃乳液的TSC瓊脂上,將平板水平靜置5-10分鐘,使接種物被吸收,然后用不含卵黃的TSC瓊脂10mL覆蓋平板表層,瓊脂凝固后,將平板置于厭氧罐內(nèi)于36+1℃,培養(yǎng)20小時(shí),取出平板,用肉眼觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)黑色菌落,挑選有20-200個(gè)黑色菌落的平板進(jìn)行記數(shù)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落一般呈黑色。

3、證實(shí)

從可記數(shù)的平板(具20-200個(gè)菌落)中挑選10個(gè)典型菌落,分別接種到液體硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基試管中,于36±1℃,培養(yǎng)18-24小時(shí),取培養(yǎng)物涂片,作革蘭氏染色鏡檢,檢查培養(yǎng)物的純度和細(xì)菌形態(tài),產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性,粗短的梭狀芽胞桿菌.對(duì)于被污染的培養(yǎng)物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上,于厭氧條件下以36±1℃,24小時(shí)培養(yǎng),以獲得純培養(yǎng)物。

上述培養(yǎng)物,以接種針穿刺接種動(dòng)力,硝酸鹽培養(yǎng)基36±1℃厭氧培養(yǎng)24小時(shí)觀察有無(wú)動(dòng)力,滴加甲萘胺液和對(duì)氨基苯磺酸液各0.5mL,觀察硝酸鹽是否被還原,取生長(zhǎng)旺盛的硫乙醇酸鈉培養(yǎng)液1mL接種含鐵牛奶培養(yǎng)基,厭氧培養(yǎng)過(guò)夜或46℃2-5小時(shí)觀察有無(wú)暴烈發(fā)酵現(xiàn)象,但培養(yǎng)基不變黑,將培養(yǎng)液點(diǎn)種卵黃瓊脂平板(每個(gè)平板至少可點(diǎn)種10點(diǎn)),倒置厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)36±1℃培養(yǎng)24小時(shí),觀察接種點(diǎn),產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶,分解卵黃中的卵磷脂,使接種點(diǎn)的底部及周圍形成乳白色的渾濁帶.此外還可作明膠液化及含1%水楊甙和含1%棉子糖的發(fā)酵試驗(yàn)等,對(duì)上述四項(xiàng)主要生化試驗(yàn),全部符合者即可確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4、結(jié)果解釋及報(bào)告

樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的計(jì)算,基于被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落的百分?jǐn)?shù)(例如10‐4稀釋的平板中,平均有85個(gè)菌落,10個(gè)菌落中,有8個(gè)被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌,那么每1g食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)即為85×(8/10)×10000=680000),報(bào)告產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌數(shù)/g(mL) 。

                          產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)檢測(cè)程序

                                    ↓

                         檢樣25g(mL)或稀釋液225mL

                                   ↓

                            TSC瓊脂混合傾注

                                   ↓

                             黑色菌落記數(shù)

                                  ↓

                     任挑黑色菌落10個(gè),分別接種FT培養(yǎng)基

                                  ↓

                               確證試驗(yàn)

                                  ↓

                            鏡 動(dòng) 銷 牛 卵

                            檢 力 酸 奶 磷

                            形 試 鹽 發(fā) 脂

                            態(tài) 驗(yàn) 還 酵 分

　　                           原　　解

                                 ↓

                               菌落計(jì)數(shù)

四、培養(yǎng)過(guò)程中芽胞形成和腸毒素的產(chǎn)生

假如對(duì)分離的菌株,直接測(cè)試芽胞和腸毒素,應(yīng)在硫乙醇酸鹽肉湯中繼續(xù)培養(yǎng),如上述,將儲(chǔ)存培養(yǎng)物移至其它實(shí)驗(yàn)室作測(cè)試時(shí),必須先將其移種至Difco公司生產(chǎn)的熟肉培養(yǎng)基中,并于35℃培養(yǎng)24小時(shí),然后再置于室溫中24小時(shí),并將此熟肉培養(yǎng)物放置在4℃保存。

用旋轉(zhuǎn)混合熟肉培養(yǎng)物,并分別各移種0.5mL至2支含10mL新鮮經(jīng)殺菌的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中,將其中1管置于有水的燒杯中,或在水浴中加熱75℃10分鐘,于35℃培養(yǎng)18小時(shí),另外1管在35℃培養(yǎng)4小時(shí),并將此培養(yǎng)物接種改良AE芽胞形成培養(yǎng)基中,用0.75mL經(jīng)4小時(shí)培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽的培養(yǎng)基,接種到芽胞肉湯中,于35℃厭氧罐中,培養(yǎng)18-24小時(shí)。

核對(duì)培養(yǎng)結(jié)果,用相差顯微鏡觀察芽胞或作涂片染色鏡檢,顯微鏡視野中少于5個(gè)芽胞的認(rèn)為芽胞形成不良。

將芽胞形成培養(yǎng)物用10000×g轉(zhuǎn)速15分鐘離心,并將無(wú)細(xì)胞的芽胞培養(yǎng)物,以反向乳凝試劑盒,檢測(cè)腸毒素。

五、控制

適宜的冷卻處理和再加熱，食品加工人員的教育。 當(dāng)產(chǎn)品達(dá)到合適溫度時(shí)，那些未被殺死的芽胞可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過(guò)快速統(tǒng)一的冷卻，事實(shí)上在所有的爆發(fā)病例中，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒(méi)有經(jīng)過(guò)恰當(dāng)冷卻事先煮好的食品，特別當(dāng)食品量又是很大時(shí)。適當(dāng)?shù)臒崽幚?，充分的再加熱，冷卻食品，也是必要的控制措施。食品加工人員的教育仍是控制的一個(gè)關(guān)鍵方面。

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