逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常被用于檢測(cè)和量化樣本中的RNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的第一步是通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)將不穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)的DNA(cDNA)。實(shí)際上,RT是許多用于研究RNA的分子生物學(xué)技術(shù)的第一步,因?yàn)閷⒉环€(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的DNA會(huì)使分析更容易、更可靠。對(duì)于RT-PCR,有一步法和兩步法。
在一步法RT-PCR中,RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一管中進(jìn)行。將RNA模板添加到試管中,加有兩種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶),以及完成反應(yīng)的所有必須組分。逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA產(chǎn)物,然后逆轉(zhuǎn)錄酶和cDNA變性,DNA聚合酶擴(kuò)增cDNA。在一步法中,RT反應(yīng)由基因特異性引物啟動(dòng)。因此,只有感興趣的區(qū)域被反向轉(zhuǎn)錄,然后進(jìn)行擴(kuò)增。
在兩步法RT-qPCR中,RT反應(yīng)與PCR擴(kuò)增單獨(dú)進(jìn)行。首先,RNA添加到反應(yīng)混合物中,混合物包括逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo-dTs (結(jié)合mRNA的poly-A尾巴)或隨機(jī)六聚體(或兩者都有),合成cDNA。下一步,從管子中取出少量cDNA,置于一個(gè)新管中,作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因?yàn)镽T反應(yīng)采用隨機(jī)啟動(dòng)或由oligo-dTs進(jìn)行啟動(dòng),總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉(zhuǎn)錄。
盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果,但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。
一步法RT-PCR
一步法原理
原理 : One step RT-PCR采用了一步反應(yīng)法完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng),即RNA-cDNA-qPCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟,就可完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng),具有方便、簡(jiǎn)捷、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn),可適用于各種動(dòng)物、植物、病毒RNA的qPCR檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn) :
1.簡(jiǎn)便操作
2.減少污染的可能性。(RT和qPCR反應(yīng)之間無需開管)。
3.另外由于得到的全部cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng)PCR擴(kuò)增,使得一步法的靈敏度更高。
4.適用于定量PCR。
缺點(diǎn) :靈敏度要比兩步法低。不適合PCR初期條件的摸索,出了問題之后不能夠很好的找到原因
兩步法RT-PCR
兩步法原理
原理 : 與一步法RT-PCR相比,兩步法RT-PCR的缺點(diǎn)包括多個(gè)步驟延長(zhǎng)了工作流程、增加樣本處理和操作步驟以及提高污染和結(jié)果變異的可能性。但是兩步法可以獲取大量的cDNA,同時(shí)可檢測(cè)單個(gè)RNA樣本中多個(gè)基因。
優(yōu)點(diǎn) : 靈敏度要比一步法高。在初期摸索PCR條件時(shí),可以很容易找到問題所在。還有更為關(guān)鍵的一點(diǎn)是,做兩步法可以節(jié)約monney,特別是寶貴的反轉(zhuǎn)錄酶,把反轉(zhuǎn)錄體系分開做,一次的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以多次用來做PCR,非常適用于摸索PCR條件。
缺點(diǎn):它更耗費(fèi)時(shí)間,且?guī)砦廴镜目赡苄愿?。RT步驟轉(zhuǎn)錄所有的RNA以相同的效率,選擇這種方法時(shí),應(yīng)該考慮到啟動(dòng)會(huì)影響qPCR的結(jié)果。如果你在PCR初期建議用一步法。如果你的條件摸索成熟建議用兩步法
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