免疫組化中，組織在福爾馬林或者其他固定液的固定過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)蛋白質(zhì)交聯(lián)而引起的抗原決定簇封閉，極大的降低抗原的檢出率和假陰性現(xiàn)象。此外，臨床病理診斷中，免疫組化的應(yīng)用廣泛，因此抗原修復(fù)成為了免疫組化極其重要的一環(huán)。不同的抗原，采取不同的適宜的抗原修復(fù)方法，才能獲得的清晰、有效的結(jié)果。一般情況下，抗原修復(fù)的方法主要有三大類：高溫高壓修復(fù)法、微波加熱修復(fù)法、酶消化法。那我們又該以何種方法來選擇呢？

絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)抗原不做任何修復(fù)，一般也能獲得相對穩(wěn)定的染色結(jié)果。但采取一些抗原修復(fù)方法，可以是抗原決定簇釋放的更加充分，進(jìn)一步提高結(jié)果的可靠性和敏感性。所以我們一般采取的是強度適中，反應(yīng)相對溫和的抗原修復(fù)方法。推薦使用微波修復(fù)法。

推薦的方法：微波加熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：常用檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）

實驗過程：微波高溫加熱 2 min（見微小波動，溫度在 90～95 ℃）后，立即轉(zhuǎn)為保溫 8 min 待緩慢降至室溫，用蒸餾水沖洗 2 次，加入 3% H2O2 8 ~10 min，在用蒸餾水沖洗 2 次，放入 PBS 中并進(jìn)入下一步驟。（提示：在實際的修復(fù)試驗中，我們還要控制好修復(fù)時間，時間過長容易導(dǎo)致過修復(fù)、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強等不利影響）

絕大多數(shù)細(xì)胞膜抗原如果不做任何修復(fù)，它的顯色結(jié)果相對于細(xì)胞質(zhì)抗原要微弱一些。主要是因為他的位置靠外，容易和固定液的甲醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，無論是形成醛鍵還是羧甲基，都會造成蛋白構(gòu)象的改變，遮蔽抗原決定簇與抗體連接。所以在細(xì)胞膜抗原修復(fù)的過程中，這個修復(fù)強度要稍微大一些，我們可以選擇微波加熱或者高壓修復(fù)（如果微波修復(fù)效果不好可以選擇）。如果是在實驗室做實驗，保守的選擇微波加熱修復(fù)，不過，對于時間和溫度的控制要稍微加長，溫度也可以略微高一些。

推薦的方法：微波加熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0），通常EDTA緩沖液的修復(fù)效果要優(yōu)于檸檬酸鹽緩沖液，國外很多實驗室傾向于應(yīng)用 DTA（pH=8.0 或 9.0）來修復(fù)。

實驗過程：微波高溫加熱 3 min（加熱到沸騰，95～100 ℃，一定要保證里面有充足的修復(fù)液，防止干片）后，立即轉(zhuǎn)為保溫 15 min 待緩慢降至室溫，用蒸餾水沖洗 2 次，加入 3% H2O2 8～10 min，在用蒸餾水沖洗 2 次，放入 PBS 中并進(jìn)入下一步驟。（提示：在實際的修復(fù)試驗中，我們還要控制好修復(fù)時間，時間過長容易導(dǎo)致過修復(fù)、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強等不利影響）

細(xì)胞核抗原處在細(xì)胞的最核心位置，它的修復(fù)難度要大于細(xì)胞質(zhì)抗原和細(xì)胞膜抗原。幾乎所有的的細(xì)胞核抗原需要應(yīng)用高壓 120 ℃ 熱修復(fù)才可以達(dá)到理想的效果，使用其他方法都很難見到不錯的效果。由于高壓熱修復(fù)的強度要大一些，本身容易脫片，所以我們在實驗的時候要做好切片的固定，這個有很多方法可以實現(xiàn)，比如烤片的時間控制、添加一些切片的粘合劑等等，大家結(jié)合自己的實驗來安排。關(guān)于修復(fù)液的選擇，如果目的抗原真的很難修復(fù)，可以選擇 pH=8.0 或 9.0 的 EDTA 緩沖液。有文獻(xiàn)描述說pH的大小與抗原修復(fù)效果成正比，這是因為在加熱或者液體中的堿性物質(zhì)可以引起蛋白質(zhì)分子之間的曼尼希反應(yīng)，非常容易破壞蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)?？蓪ｉT用來針對那些有難度的細(xì)胞核抗原的修復(fù)，也就是說 EDTA 緩沖液的修復(fù)效果要優(yōu)于檸檬酸鹽緩沖液，國外很多實驗室也傾向于應(yīng)用DTA（pH=8.0 或 9.0）來修復(fù)（有時間最好兩種修復(fù)液都做一下，加深感受，有助于提升實驗技能）。

推薦的方法：高壓熱修復(fù)法

推薦的修復(fù)液：檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）或 EDTA（pH=8.0 或 9.0）

實驗過程：高壓鍋加熱到噴氣開始再加熱 2 min（一定要保證里面有充足的修復(fù)液，防止干片）后，立即將高壓鍋端離火源，一定要等蒸汽排放完成以后，再打開鍋蓋，待緩慢降至室溫，用蒸餾水沖洗 2 次，加入 3% H2O2 8 ~10 min，在用蒸餾水沖洗 2 次，待進(jìn)入下一步驟。（提示：在實際的修復(fù)試驗中，我們還要控制好修復(fù)時間，時間過長容易導(dǎo)致過修復(fù)、組織破壞和非特異性反應(yīng)增強等不利影響）

免疫組化中一些特殊類型的修復(fù)，都是一些經(jīng)驗性的總結(jié)，比如 CD4/CD8/CD25/CD1a 需先用 3% H2O2 浸泡 8 min，后用蒸餾水沖洗兩次，再用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行修復(fù)。其染色結(jié)果就非常理想，反之陽性信號減少，陽性細(xì)胞也變少了。還有一些抗原修復(fù)以后反而假陰性大大增加。舉個例子 HBcAg 是乙肝病毒的核殼結(jié)構(gòu)蛋白，是 HBV 的核心部分。黃建平等對其進(jìn)行 3 種抗原修復(fù)的方法對比發(fā)現(xiàn)，不修復(fù)染色最好，高壓熱修復(fù)效果最差。原因是因為甲醛固定的是肝細(xì)胞，并沒有固定到乙肝病毒上。高溫高壓的修復(fù)，反而導(dǎo)致乙肝病毒的蛋白質(zhì)變性，極大的影響了染色結(jié)果。對于特殊類型抗原的修復(fù)，是因為我們對抗原修復(fù)的機制研究尚不*，還有很多問題沒有搞清楚。這種方法的積累來源于實驗經(jīng)驗的積累和汲取，所以鼓勵大家多看看相關(guān)類型文獻(xiàn)，可以幫助少走彎路。