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細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)與方法
具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)凋亡的不同階段有以下一些方法：
1．早期檢測(cè):
1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè):
PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生,可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
BioVision公司位于美國(guó)加州，是世界上專著于凋亡和細(xì)胞信號(hào)研究的公司。其產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉、包裝使用方便。BioVision提供多種標(biāo)記的AnnexinV產(chǎn)品，并有與核染料PI組成完整早期凋亡檢測(cè)試劑盒。
2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：
正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類(lèi)型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
由于GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測(cè)。
3）細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)
細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。CytochromecApoptosisAssayKit試劑盒可以有效地檢測(cè)凋亡過(guò)程中細(xì)胞色素c的釋放情況。
4)線粒體膜電位變化的檢測(cè)：
在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。Biovision公司的MitoCaptureTMMitochondrialApoptosisDetectionKit（MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測(cè)試劑盒）可以簡(jiǎn)單、靈敏地體外分析、檢測(cè)線粒體在凋亡過(guò)程中的變化。
2．晚期檢測(cè)：
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200bp的DNA片段。
1）凋亡DNALadder檢測(cè)試劑盒
細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder。QuickApoptoticDNALadderDetectionKit可以快速（約1-2小時(shí)）、靈敏地檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的DNA片段。
2）TUNEL-basedDNA片段分析試劑盒
細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。Apo-BrdUTM分析使用2種顏色的TUNEL方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞中DNA條帶。采用的BrdU比生物素標(biāo)記的或（digoxigenylated）標(biāo)記的方法靈敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一種完整的試劑盒用于雙色的免疫組化（IHC）檢測(cè)DNA片段。Apo-DIRECTTM是非常簡(jiǎn)單的一步標(biāo)記凋亡細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)分析。
3）Caspase分析試劑和試劑盒
Caspase在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，屬于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。在正常狀態(tài)下，caspase家族都以無(wú)活性的酶原(30～50kD)形式表達(dá)，Caspase酶原由原結(jié)構(gòu)域、大亞基（～20kD）和小亞基(～10kD)構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)caspase可以被蛋白酶裂解，大亞基和小亞基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促發(fā)細(xì)胞凋亡。
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