在多肽類藥物的生產(chǎn)質(zhì)控中，氨基酸序列的測定是必不可少的檢測項(xiàng)目。對于常規(guī)組成單一的合成多肽藥物來說，氨基酸序列的分析較為簡單，可通過Edman降解法或質(zhì)譜法進(jìn)行測定，其中Edman降解法被認(rèn)為更加直接可靠。但對于組成復(fù)雜的混合多肽藥物來說，比如，醋酸格拉替雷（Glatiramer acetate，簡寫為GA），由于多肽組成形式復(fù)雜多變，可能具有超過一萬億個不同序列的*多肽，如果對每種多肽成分的氨基酸序列進(jìn)行精確測定，似乎既不可能，其實(shí)也無必要，我們需要考慮新的方法對混合多肽進(jìn)行整體表征。

n 快速了解醋酸格拉替雷

醋酸格拉替雷是一種人工合成的多肽類制劑，由Glu（谷氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）和Lys（賴氨酸）四種氨基酸隨機(jī)聚合而成，原研藥由以色列藥廠TEVA研發(fā)制造（商品名Copaxone），于1996年獲美國FDA核準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥（MS），其2020年全球銷售額達(dá)到13.37億美元，2021年7月，TEVA的“醋酸格拉替雷注射液”在中國的上市申請獲得受理。多發(fā)性硬化癥是一種常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)包括視物模糊，感覺、運(yùn)動異常，智能、情感等高級功能障礙，在中青年人群中多發(fā)，且有較高致殘率。醋酸格拉替雷被認(rèn)為是通過改變造成MS發(fā)病機(jī)制的免疫過程而起作用的，其療效與耐受性在臨床上獲得了十足的肯定。

醋酸格拉替雷是一種由Tyr、Lys、Glu、Ala隨機(jī)聚合而成的多肽混合物

（CAS號：147245-92-9）

醋酸格拉替雷的第一個仿制藥Glatopa （由Sandoz 公司和 Momenta公司共同開發(fā)）于2015年上市，由于原研藥的專利到期，未來將有更多的仿制藥上市。

n 醋酸格拉替雷的合成與質(zhì)量評估

在醋酸格拉替雷的生產(chǎn)過程中，通過聚合及解聚反應(yīng)，可以將其分子量控制在一個較窄的范圍（平均分子量4700～11000 Da）。生產(chǎn)工藝的改變以及所用試劑的變化都有可能使藥物的組分比例發(fā)生變化。利用Edman降解法，通過監(jiān)測N端每一個循環(huán)的4種氨基酸的組成比例以及變化趨勢，可以對藥品質(zhì)量進(jìn)行評估。

島津解決方案

l 蛋白質(zhì)測序儀對醋酸格拉替雷進(jìn)行質(zhì)量評價的原理

Edman降解法是進(jìn)行N端氨基酸序列分析的經(jīng)典方法，島津以其為原理設(shè)計的全自動蛋白質(zhì)測序儀（以下簡稱PPSQ），由液相系統(tǒng)和可執(zhí)行自動化Edman降解反應(yīng)的主機(jī)組成，將氨基酸從多肽鏈的N端依次切割下來，通過色譜的保留時間判定氨基酸種類，結(jié)果直接可靠。PPSQ除了對N端氨基酸序列進(jìn)行定性分析外，利用液相色譜穩(wěn)定的定量能力，還可以對多肽特定循環(huán)氨基酸的摩爾生成量及組成比例進(jìn)行定量分析。

島津在售蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-51/53A

Edman降解反應(yīng)圖解

l 樣品前處理

取適量稀釋后的樣品加入經(jīng)聚凝胺處理的玻璃纖維膜上，干燥后安裝到PPSQ反應(yīng)器上進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)僅作示例，共測試了3個批次的原研藥Copaxone以及4個批次的某在研仿制藥，每個批次測試N端前6個循環(huán)。

反應(yīng)器構(gòu)造圖

l 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）N端氨基酸組成定性分析

醋酸格拉替雷原研藥每個循環(huán)均檢測到Glu、Ala、Tyr、Lys等4種氨基酸，這與藥品由Glu、Ala、Tyr、Lys等4種氨基酸隨機(jī)聚合而來，結(jié)果一致。

醋酸格拉替雷原研藥Copaxone與某在研仿制藥N端氨基酸分析色譜圖示例（1-6循環(huán)）

（黑色：原研藥Copaxone；紅色：某在研仿制藥；DTT、DMPTU、DPTU為試劑峰）

2）各循環(huán)中每種氨基酸的相對摩爾含量的分析

根據(jù)儀器自動生成的氨基酸生成量，計算每種氨基酸的摩爾含量，例如，Glu的相對摩爾含量為：

根據(jù)氨基酸的相對摩爾含量，繪制各循環(huán)中各氨基酸生成量的趨勢圖，如下。

醋酸格拉替雷Copaxone 與某在研仿制藥N端前6個循環(huán)相對氨基酸水平分析

（縱坐標(biāo)：相對摩爾含量；橫坐標(biāo)：循環(huán)數(shù)）

3）原研藥與某在研仿制藥的比較

從趨勢圖來看，仿制藥各循環(huán)氨基酸生成量趨勢，與原研藥整體相似，但GA仿制藥-批次1的Glu的相對含量略低，GA仿制藥-批次4的各循環(huán)Tyr的相對含量略高，批次1中Glu的偏低與批次4中Tyr的偏高是否正常，需要對原研藥進(jìn)行多批次實(shí)驗(yàn)，以判斷是否超出正常范圍。GA仿制藥-批次2及GA仿制藥-批次3的Tyr生成量趨勢與其他樣品有明顯不同，提示仿制藥生產(chǎn)工藝可能存在與原研不同的地方。

結(jié) 語

通過醋酸格拉替雷N端各氨基酸生成量的趨勢變化的分析比較，可為仿制藥的開發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)控提供參考，醋酸格拉替雷N端相對氨基酸水平分析亦可作為醋酸格拉替雷仿制藥與原研藥一致性評價的依據(jù)。這也為我們今后分析類似混合蛋白或多肽藥物提供了參考思路。

參考文獻(xiàn)：

J. Andersona, C. Bell, et al., Demonstration of equivalence of a generic glatiramer acetate (Glatopa™), Journal of the Neurological Sciences 359 (2015) 24–34

撰稿人：頓俊玲

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