血清淀粉樣蛋白A(SAA)重組蛋白的應(yīng)用！

一、背景

血清淀粉樣蛋白A(SAA)重組蛋白是一種非特異性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其作為炎癥標(biāo)志物的臨床價(jià)值近年來(lái)得到廣泛關(guān)注。SAA水平變化對(duì)于感染性疾病的早期診斷、危險(xiǎn)評(píng)估、療效觀察及預(yù)后評(píng)價(jià)都具有重要臨床價(jià)值。除了在細(xì)菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦顯著升高，根據(jù)其升高的程度或與其他指標(biāo)聯(lián)合運(yùn)用，可以提示細(xì)菌性或病毒性感染，從而彌補(bǔ)了目前常用炎癥標(biāo)志物不能提示病毒感染的不足。

血清淀粉樣蛋白A(SAA)是一種非特異性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其作為炎癥標(biāo)志物的臨床價(jià)值近年來(lái)得到廣泛關(guān)注。SAA水平變化對(duì)于感染性疾病的早期診斷、危險(xiǎn)評(píng)估、療效觀察及預(yù)后評(píng)價(jià)都具有重要臨床價(jià)值。除了在細(xì)菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦顯著升高，根據(jù)其升高的程度或與其他指標(biāo)聯(lián)合運(yùn)用，可以提示細(xì)菌性或病毒性感染，從而彌補(bǔ)了目前常用炎癥標(biāo)志物不能提示病毒感染的不足。

人體A-SAA主要在肝臟中合成，由細(xì)胞因子IL-1β，IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)，這些細(xì)胞因子可以與糖皮質(zhì)激素協(xié)同作用以增強(qiáng)A-SAA產(chǎn)生。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在未患任何疾病的肥胖個(gè)體者的脂肪細(xì)胞中可見(jiàn)大量的A-SAA mRNA表達(dá)，這意味著A-SAA并不只在肝臟合成。

SAA具有以下生物學(xué)功能：

(1)SAA具有促炎活性，在SAA質(zhì)量濃度低至10μg/L時(shí)，具有誘導(dǎo)趨化因子和趨化白細(xì)胞遷移的能力;

(2)SAA已被描述為血管生成蛋白，在SAA質(zhì)量濃度大于10～60 mg/L時(shí)，可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和形成的毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)，刺激體內(nèi)新血管形成;

(3)SAA在生理水平通過(guò)結(jié)合外膜蛋白A作為革蘭陰性菌的調(diào)理素，從而增強(qiáng)細(xì)菌的吞噬作用，并且能夠在合成、重建細(xì)胞膜時(shí)形成離子通道，干擾細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)并引起細(xì)菌裂解;

(4)SAA具有抗病毒活性，但這種抗病毒活性可能限于丙型肝炎病毒;

(5)SAA具有誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶的能力。

二、應(yīng)用

用于血清淀粉樣蛋白A1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究：

目的：

1、通過(guò)轉(zhuǎn)染SAA1慢病毒,明確SAA1高表達(dá)對(duì)AS斑塊穩(wěn)定性的影響；

2、探討SAA1慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)斑塊內(nèi)脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及膠原的影響；

3、通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確SAA1對(duì)膠原表達(dá)的影響及其相關(guān)信號(hào)通路。

研究方法：

1、SAA1高表達(dá)慢病毒的構(gòu)建獲取目的基因后,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后將目的基因片段與慢病毒載體plenti6.3-MSC-IRES-EGFP連接,構(gòu)建成plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP,并經(jīng)轉(zhuǎn)化、包裝后測(cè)定慢病毒的滴度,用于實(shí)驗(yàn)。

2、動(dòng)物飼養(yǎng)及建模將100只6-8周齡的雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給予頸動(dòng)脈套管。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后,隨機(jī)將剩余的95只ApoE-/-小鼠分為4組:Control組（n=23）、lenti-null組(n=25、low-lenti-SAA1組（n=23）及high-lenti-SAA1組（n=24）。Lenti-null組給予1x107TU空慢病毒載體,low-lenti-SAA1組給予1×107TUSAA1高表達(dá)慢病毒,high-lenti-SAA1組1×109TUSAA1高表達(dá)慢病毒,control組給予相同體積生理鹽水。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后,小鼠空腹12小時(shí),稱體重,以0.8%戊麻醉,打開(kāi)胸腔,心臟取血,置于-80度冰箱保存,以備后續(xù)檢測(cè)。以生理鹽水灌洗心臟和主動(dòng)脈,沖洗出殘余血液。部分動(dòng)物繼以4%多聚甲醛固定直至肝臟變硬,收集小鼠套管近端的頸動(dòng)脈,以4%多聚甲醛浸泡24小時(shí)。其余部分動(dòng)物的頸動(dòng)脈標(biāo)本置于-80度冰箱保存。

3、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）以ELISA法檢測(cè)血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三脂及TNF-α、IL-6的濃度。

4、頸動(dòng)脈油紅O染色對(duì)小鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行5μm連續(xù)切片,每10張取1張用于油紅O染色,病變的嚴(yán)重程度用斑塊占頸動(dòng)脈斑塊面積的百分比來(lái)表示。

5、組織免疫組織化學(xué)染色對(duì)冰凍切片行SAA1、α-SMC actin、MOMA-2、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8免疫組化染色觀察SAA高表達(dá)對(duì)斑塊SAA、α-SMC actin、MOMA-2、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8的影響。

6、Western blot檢測(cè)定量稱取凍存組織,或收集細(xì)胞,提取蛋白,采用western blot法,以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)SAA1、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8、MMP2、MMP9的表達(dá)；以相應(yīng)非磷酸化狀態(tài)為內(nèi)參檢測(cè)p-p38、ERK1/2、JNK、Smad2、Smad3的表達(dá)。

7、實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)定量稱取凍存組織,Trizol法提取總RNA,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后以18S為內(nèi)參檢測(cè)SAA1的表達(dá),以確定SAA1高表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染效果。

8、免疫熒光染色重組SAA1蛋白刺激平滑肌細(xì)胞后,免疫熒光法檢測(cè)膠原I、膠原III、MMP1和MMP8的表達(dá)。

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料應(yīng)用Student t檢驗(yàn),多組采用方差分析（ANOVA）,非正態(tài)分布的資料行Mann-Whitney檢驗(yàn)。設(shè)P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果：

各組小鼠的一般情況Control組（n=23）、lenti-null組（n=25）、low-lenti-SAA1組（n=23）及high-lenti-SAA1組（n=24）ApoE-/-小鼠的體重及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平濃度無(wú)差異（P>0.05）。表明SAA1高表達(dá)慢病毒的局部轉(zhuǎn)染,沒(méi)有影響小鼠體內(nèi)整體的脂質(zhì)代謝。2.plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)血清SAA1及其他炎癥因子表達(dá)的影響Control組、lenti-null組、1ow-lenti-SAA1組的血清SAA1表達(dá)幾乎沒(méi)有變化,high-lenti-SAA1組的血清SAA1表達(dá)略高于前三組,但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；這四個(gè)組的炎癥因子TNF-α、IL-6在血清中的分泌表達(dá)也未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。表明慢病毒的局部轉(zhuǎn)染,沒(méi)有引起小鼠體內(nèi)顯著的炎癥反應(yīng)。