蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)是目前小分子藥物研發(fā)領(lǐng)域最火熱的技術(shù)之一。它dian覆了傳統(tǒng)藥物化學(xué)中“占位驅(qū)動 (occupancy driven)”的開發(fā)理念，借助內(nèi)源性的泛素蛋白酶體系統(tǒng)有效地特異性降解致病蛋白，尤其是“不可成藥（undruggable）”靶點。如此優(yōu)秀的技術(shù)，不但讓國內(nèi)外眾多制藥巨tou和Biotech公司趨之若鶩，更為科學(xué)家們打開了新世界的大門。Chinese Academy of Sciences司龍龍課題組剛剛在Nature子刊發(fā)表了基于PROTAC技術(shù)的流感疫苗[1]doi: 10.1038/s41587-022-01381-4，沈陽藥科大學(xué)陳麗霞和李華團隊又創(chuàng)造性地將這項技術(shù)引入到了中藥研究領(lǐng)域，在Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）發(fā)表了題為“PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids”的研究論文 [2] doi: 10.1016/j.apsb.2022.07.007。

中藥活性成分和其作用靶點的鑒定均在中藥研發(fā)領(lǐng)域具有重要的科學(xué)意義和實用價值。尤其是靶點鑒定，它是理解中藥機制和下游藥物開發(fā)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。但由于中藥“多靶點、多成分”的作用模式，以及與靶點蛋白瞬時、弱親和力的相互作用，導(dǎo)致中藥的靶點鑒定存在巨大挑戰(zhàn)，亟需研究的思路創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新。

PROTAC技術(shù)中的蛋白降解劑是一種含有兩個活性端的小分子化合物，一個活性端可與靶蛋白結(jié)合而另一個活性端結(jié)合E3連接酶；兩個活性端通過linker相連接。鑒于PROTAC分子往往無需很強的親和力即可有效地特異性降解靶蛋白，沈陽藥科大學(xué)的研究團隊大膽猜想該技術(shù)可用于鑒定中藥成分及天然產(chǎn)物的作用靶點。研究人員將PROTAC技術(shù)與定量蛋白組學(xué)、微量熱泳動（MST）分子互作檢測技術(shù)相結(jié)合，從被降解的差異蛋白中找到中藥靶點，并通過下游的一系列分子、生物化學(xué)和動物實驗得到了功能驗證。該流程被研究團隊稱為“靶向降解組學(xué)”，可以為中藥成分的靶點鑒定提供新的解決方案。

沈陽藥科大學(xué)陳麗霞和李華團隊在前期研究中從中藥千金子中獲得了一系列千金烷二萜類化合物，其中ZCY-001化合物具有zui強的抗炎活性，并且具有低毒性。

研究人員將該化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）與沙利度胺 (E3連接酶CRBN配體) 通過PEG linker相連，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用該PROTAC分子對細胞進行處理后提取蛋白，并使用TMT串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽進行標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析（圖1 A）。比較蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAFF蛋白在ZCY-PROTAC處理后發(fā)生了zui為顯著的降解。Western Blot結(jié)果也顯示, MAFF蛋白的降解水平與ZCY-PROTAC的劑量和作用時間是正相關(guān)的（圖1 B）。

這些結(jié)果表明，該蛋白可能是Lathyrol等千金烷二萜類化合物的最主要靶點。

圖1 ZCY-PROTAC可顯著降解MAFF蛋白

為了驗證比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)的靶點蛋白，研究人員采用微量熱泳動(MST）技術(shù)直接檢測Lathyrol及其衍生物ZCY020與MAFF蛋白的結(jié)合能力。

如下圖所示，Lathyrol與MAFF的親和力為20.90 μM，ZCY020對MAFF的親和力也在同一水平。以上親和力檢測結(jié)果也通過表面等離子共振（SPR）、細胞熱遷移分析（CETSA）以及DARTS等實驗得到了驗證。這些結(jié)果證實了MAFF蛋白是中藥千金子成分的直接作用靶點。

圖2 微量熱泳動技術(shù)（MST）檢測中藥千金子活性成分與MAFF蛋白相互作用

研究人員進一步采用生化和藥理學(xué)實驗深入研究闡明了千金烷二萜ZCY020以MAFF為靶點蛋白, Nrf2/HO-1信號通路為作用途徑發(fā)揮抗炎作用。ZCY02可以促進MAFF-Nrf2異源二聚體的形成而抑制MAFF同源二聚體，進而調(diào)節(jié)HO-1的下游表達，從而在體內(nèi)外發(fā)揮抗氧化和抗炎活性。

本研究創(chuàng)造性地將PROTAC技術(shù)應(yīng)用在了中藥成分靶點的鑒定上，首先以中藥活性成分為基礎(chǔ)合成出PROTAC分子探針，再通過蛋白的特異性降解來發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的靶點蛋白。以MST為代表的的分子互作檢測技術(shù)在靶點驗證中發(fā)揮了重要作用，可直接定量分析中藥活性成分與靶點蛋白的親和力。作者將這一系列技術(shù)手段整合為一套可行的中藥成分靶點鑒定新方法，可以有力地補充甚至替代現(xiàn)有技術(shù)。

德國NanoTemper公司自2010年推出di一款基于微量熱泳動技術(shù)的Monolith分子互作儀。隨著工業(yè)用戶的增多且對高通量檢測的需求越來越迫切，NanoTemper公司于2014年推出了自動化的檢測儀器Monolith NT.Automated?；谟脩舻姆答?，在2020年對該產(chǎn)品線進行了全面升級，推出了全新的Monolith系列儀器。

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產(chǎn)品特點：

• 僅需微量樣品，即可直接在溶液中測定分子間結(jié)合。

• 無需固定，不受檢測樣品種類的限制。

• 檢測速度快、測量范圍廣 (K_d : 從pM到mM)。

• 儀器操作簡單，無需繁瑣的清洗維護。