一 ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)）/FluoroSpot（熒光免疫斑點技術(shù)）的區(qū)別

 
ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)）

 
FluoroSpot（熒光免疫斑點技術(shù)）

FluoroSpot是在ELISpot基礎上發(fā)展起來的，使用熒光檢測代替比色法。熒光免疫斑點實驗結(jié)合了ELISpot的靈敏性和同時分析幾種分析物分泌的能力，適用于單次檢測和大規(guī)模篩選不同功能特征的細胞群檢測。熒光免疫斑點實驗是將夾心法與熒光標記檢測法相結(jié)合，對同一孔內(nèi)的兩種或多種分析物進行檢測。 

 
案例說明：通過ELISpot和FluoroSpot分析檢測分析食蟹獼猴外周血單個核細胞（PBMC）分泌的IFN-γ和IL-2。PBMC僅在培養(yǎng)基中孵育過夜，或用恒河猴巨細胞病毒pp65或抗cd3單抗刺激。
A)    ELISpot：使用單抗組合MT126L和7-b6-1-生物素和IL-2使用單抗組合MTA91/MT2C95和MT8g10-生物素進行分析。
B)FluoroSpot：IFN-γ和IL-2使用與ELISpot相同的抗體，但在相同的井中。所示圖像代表了490/550的IFN- γ響應，以及550/570 nm的IL-2響應。圖中還顯示了IFN-γ和IL-2圖像（IFN-γ + IL-2）的計算機覆蓋分析，其中雙產(chǎn)生細胞顯示為黃色斑點。實驗重復進行，結(jié)果具有可重復性。

二 ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)）相關(guān)問題答疑
ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)）是一種基于ELISA基本原理建立的、高靈敏的細胞因子方法，能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴毎M行功能性檢測，具有較髙的特異性、直觀可信度髙，并且易操作，已被廣泛用于細胞因子分泌細胞（CK）或抗體分泌細胞（ASC）測定中，在國內(nèi)外免疫學界獲得了廣泛的應用。

該檢測技術(shù)主要的分析步驟有：樣本制備、包被單抗、細胞+抗原刺激+孵育、檢測抗體的加入與孵育、顯色與讀板。本期就結(jié)合以上主要操作流程，對常見的ELISPOT應用中常見的問題進行分析與解答。

1.    樣本制備

1.1 可檢測的細胞類型有哪些？

原則上，任何可以分泌蛋白質(zhì)的細胞都可以進行檢測：
貼壁細胞在進行檢測步驟之前，需要進行裂解步驟，以從ELISPOT板上去除所有細胞；
新鮮和冷凍保存的PBMC都可用于ELISPOT和FluoroSpot分析；
對于T細胞，強烈建議使用新鮮的嚙齒動物脾臟細胞進行測定，因為該細胞的冷凍保存過程太復雜，并且冷凍保存對脾細胞活力和功能有負面影響。

目前主要用于鑒定：抗原激活分泌細胞因子的T細胞，外周血&脾臟細胞中分泌抗體的B細胞。
 

1.2 可以檢測哪些品種的樣本？

需要確定待測物種是否能產(chǎn)生想要研究的細胞因子，一些動物樣本只有在體內(nèi)受到適當抗原刺激后，才會分泌細胞因子。ELISPOT是體外檢測，故而可能不滿足一些特定的分泌條件。
 

1.3 血液儲存及運輸條件

全血樣本應在室溫（20-26℃）條件下，儲存不超過8小時；
抗凝血劑推薦肝素+檸檬酸鹽，這兩種物質(zhì)，在測定中沒有報告對細胞功能的不利影響。
不推薦EDTA（EDTA通過鈣螯合抑制凝血，鈣螯合在抗原特異性再刺激期間損害細胞因子誘導）。
   

1.4 使用PBMC樣本進行檢測時，有哪些需要注意的事項？

首先，單核細胞作為T細胞的抗原遞呈細胞（APC）至關(guān)重要，單核細胞數(shù)量過少會導致T細胞ELISPOT/FluoroSpot測定中的斑點數(shù)降低，特別是冷凍保存的樣本
，因此需補充單核細胞。
其次，PBMC制劑中死細胞的存在會影響T細胞與B細胞的測定結(jié)果，建議在樣本制備時，進行細胞計數(shù)并計算細胞活率。細胞活率大于80%的樣本即可進行檢測，否則由于操作過程中的損失及自然凋亡，最后檢測時形成的斑點數(shù)也會減少。

人IFN-γ T細胞ELISPOT結(jié)果示例（銀染）：2x105PBMC/孔
     
單核細胞耗盡樣品

正常樣品

2.    單抗包被

2.1 適合進行ELISPOT檢測的抗體有哪些？
在 ELISA 系統(tǒng)中適合的一抗和二抗并不意味著這些抗體也是 ELISPOT 測定的最佳抗體。ELISPOT抗體對由制造商在廣泛的優(yōu)化和驗證的基礎上選擇，并應用作ELISPOT測定的匹配抗體對。

 
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2.2抗體包被耗時多久？
包被好的檢測板，需放置在加濕室（卡盒塑料容器，底部有濕紙巾），4℃的條件下過夜保存。

2.3抗體包被應在何時進行？
   
抗體的包被可以提前7天進行，涂覆后使用無菌PSB洗滌，并用封閉溶液進行封閉。使用封板摸密封的ELISPOT板應及時儲存在4℃，防止蒸發(fā)，若需長時間保存，則應保證環(huán)境無菌。

2.4 包被結(jié)束后各種試劑如何保存？

封閉液可以在室溫放置數(shù)小時，或者4℃保存
檢測抗體在室溫下放置2小時，或者4℃保存
偶聯(lián)物需避光保存，室溫下放置1小時，或者4℃保存

3.    細胞+抗原刺激+預孵育
3.1 單孔需添加的細胞數(shù)量建議值？
ELISPOT和FluoroSpot檢測的靈敏度在很大程度上取決于細胞密度。
細胞數(shù)量是否太少，則不足以獲得最佳反應；過多的細胞會導致單個斑點重疊和高背景染色。
因此我們建議，在添加細胞樣本之前進行細胞計數(shù)，保證細胞密度不超過3x10E5/mL 。

人IgG B細胞ELISPOT結(jié)果示例（酶染色）：
在體外預孵育步驟中用IL-2和R848激活記憶B細胞。
顯示：IgG分泌細胞的總數(shù)。

           
5x10E3個斑點   

5x10E5個斑點（太多斑點無法計數(shù)）

3.2 刺激后的孵育時間需要多久？
一般來說，孵育的時間在12-48h之間，建議是在16h左右，也需根據(jù)細胞因子免疫反應強度來判斷：如果免疫反應較強，則孵育12h；若反應較弱，則孵育48h。此外應注意，長時間的孵育（48h-72h）可能會導致板底PVDF膜滲漏。

T細胞ELISPOT檢測：
當使用全長蛋白質(zhì)或長肽用作為ELISPOT測定中的刺激物，且細胞密度>10E6/well/mL時，可能需要24-42小時的孵育。
?。ê铣桑╇模?-12聚體）可以由APC直接呈遞給CD8+細胞，因此不需要預育步驟。

B細胞ELISPOT檢測：
靜止記憶B細胞在體內(nèi)不會產(chǎn)生大量抗體。因此，在高細胞密度（>10E6cell/well/mL）的條件下，根據(jù)細胞類型的不同，所需的預孵育時間在2-5天左右。

3.3如何設置合理的對照？
陽性對照——細胞經(jīng)特異性抗原或多克隆抗體刺激  用來確定試劑盒正常工作，細胞功能完整；排除假陰性結(jié)果
陰性對照——細胞不經(jīng)刺激  用來確定自發(fā)分泌因子的細胞個數(shù)；排除假陽性結(jié)果
背景對照——不加細胞和其他所有試劑  用來排除試劑或其他介質(zhì)的影響產(chǎn)生的斑點；排除假陽性結(jié)果

3.4完成加樣及刺激后，單孔的體積是多少？
在結(jié)束細胞鋪板與抗原刺激后，需確認并檢查整個實驗的體系是否正確，包括溶液的體積、標簽及排布，其中單孔體積（總計200μ）應包含：100μL單細胞懸液，100μL抗原刺激物。

3.4使用具有傳染性病的原體時，如何對細胞板進行凈化？

如果附有PVDF膜的ELISPOT板中，發(fā)生了污染，諸如包膜病毒（例如HIV，SIV）的感染因子，則可以在shou

選的細胞孵育時間后對孔進行去污，。

首先從孔中吸取出細胞，然后用加了300μl4%多聚甲醛的PBS洗滌5次 ，然后在室溫（20-26°C）下孵育，<5分鐘，之后ELISPOT板可以繼續(xù)進行其他的清洗步驟。
這些清洗步驟可能導致略高的背景染色，但對T細胞ELISPOT測定中的斑點數(shù)量和大小不會產(chǎn)生不利影響。

3.5 在孵育時，培養(yǎng)箱容積不足，可以堆疊放置ELISPOT板嗎？

不可以，堆疊拜訪可能會造成單孔溫度變化不均，導致最后形成的斑點大小、數(shù)量發(fā)生變化。

3.6 ELISPOT 常見細胞及刺激劑

4.    檢測抗體的加入與孵育

4.1整個實驗過程都需要在超凈臺/生物安全柜中進行嗎？
前期的包板、孵育、加樣、刺激等操作，均需要保持操作環(huán)境無菌，此后都不強制要求保持無菌，檢測抗體、顯色液、緩沖液的加入均可在一般實驗環(huán)境下進行。

4.2孵育條件？

在4℃保濕箱中儲存18小時

5.    顯色與讀板

5.1 該技術(shù)可檢測的斑點類型？
ELSPOT是基于酶標的顯色原理，F(xiàn)luoroSpot是基于熒光的顯色原理，所以最后的檢測斑點會有所不同。
ELISPOT的酶標記物可以是HRP或者ALP
對應的顯色底物分別是：BCIP/NBT、Fast red、TMB、AEC

 
FluoroSpot的熒光標記物較為常見的有FITC、CY3等
 
（優(yōu)寧維提供AID酶聯(lián)免疫斑點分析儀，在標配FITC、CY3通道之外，可根據(jù)標記物不同選配其他通道）

5.2 可以被判定為分泌了細胞因子的斑點有什么特點？如何避免誤判？

真正的由于細胞因子分泌沉淀形成的斑點應具有致密的中心以及蛋白質(zhì)擴散產(chǎn)生的輕外環(huán)，光斑大小在5000-10000平方微米；小而暗、邊緣鋒利、強度均勻、人工斑點與污垢、都不是真正的斑點。
因此，在使用軟件進行結(jié)果評估時，需要為要計數(shù)的最小光斑尺寸設置不同分析的截止值，并且必須定義最大光斑尺寸以識別細胞簇，為每種不同的ELISPOT/FluoroSpot測定建立絕對設門標準。最小和最大“門”集將嚴重影響計數(shù)的點數(shù)。

5.3 產(chǎn)生條紋狀斑點的原因？
首先，某些刺激觸發(fā)趨化因子的釋放，導致T細胞在孵育期間四處移動，在孔中產(chǎn)生細胞因子痕跡，當T細胞被多克隆刺激（如絲裂原和抗CD3 / CD28抗體）激活時尤其如此。
其次，細胞孵育過程中板的運動可能導致細胞滾動，從而產(chǎn)生不規(guī)則或長方形斑點。

5.4 成像結(jié)果出現(xiàn)小黑點的原因？
如果經(jīng)過目視評估，這些“斑點”大小不一、高度不規(guī)則，則孔中可能存在灰塵顆粒。通過將 4-5 bar 的壓縮空氣吹入井孔中，可以輕松解決這個問題。

5.5 顯色后檢測板的干燥與儲存條件？

顯色結(jié)束后，應將去除封板膜，將檢測板倒置，在室溫（20-26℃）下避光干燥，以防止光照導致斑點漂白。

結(jié)語：
優(yōu)寧維提供ELISPOT檢測全流程解決方案：
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