負(fù)壓微環(huán)境對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 新生的影響及其機制

  本文亮點：

        (1) 利用自主研發(fā)的全自動三維細(xì)胞梯度負(fù)壓加載裝置，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）進(jìn) 行間歇負(fù)壓吸引，觀察到體外負(fù)壓處理可顯著促進(jìn) HUVEC 的增殖、遷移與成管。

        (2) 推測對 HUVEC 的負(fù)壓刺激可能通過上調(diào)熱休克蛋白 90 的表達(dá) ，抑制窖蛋白 1 與內(nèi)皮型 NOS （eNOS）的結(jié)合 ，解除窖蛋白 1 對 eNOS 磷酸化位點 1177 的抑制以激活 eNOS，從而促進(jìn) HUVEC 新生。

        【摘要】 目的 探究負(fù)壓微環(huán)境對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）新生的影響及其機制。

             方法 采用實驗研究方法。取第 3~5 代對數(shù)生長期 HUVEC 進(jìn)行后續(xù)實驗。取 3 批細(xì)胞，各批次細(xì)胞 均分為常規(guī)培養(yǎng) 24 h 的正常對照組和單純負(fù)壓處理組以及加入 17-丙烯胺基-17-去甲氨基格爾德霉 素（17-AAG）培養(yǎng) 24 h 的單純 17-AAG 組與 17-AAG+負(fù)壓處理組，另采用自行設(shè)計研發(fā)的全自動三維 細(xì)胞梯度負(fù)壓加載裝置對 2 個負(fù)壓處理組細(xì)胞行持續(xù) 8 h 的間歇負(fù)壓吸引（負(fù)壓值為?5.33 kPa，吸引 30 s、暫停 10 s），第 1 個批次細(xì)胞處理完成后于培養(yǎng) 0（即刻）、24、48、72 h，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒 8 法檢 測細(xì)胞增殖水平，樣本數(shù)為 6；第 2 個批次細(xì)胞處理完成后進(jìn)行劃痕試驗，于劃痕后 12 h，在倒置相差 顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況后計算細(xì)胞遷移率，樣本數(shù)為 3；第 3 個批次細(xì)胞處理完成后進(jìn)行小管形 成實驗，于培養(yǎng) 6 h，在倒置相差顯微鏡下觀察成管情況后計算細(xì)胞成管總長度與分支節(jié)點數(shù)，樣本數(shù) 為 3。取細(xì)胞，分為正常對照組、單純負(fù)壓處理組、17-AAG+負(fù)壓處理組，同前相應(yīng)組別進(jìn)行處理，處 理完成后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中熱休克蛋白 90（HSP90）、窖蛋白 1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （eNOS）、eNOS 磷酸化位點 1177 蛋白表達(dá)并計算 eNOS 磷酸化位點 1177/eNOS 比值（樣本數(shù)為 3），采用 免疫共沉淀（共沉淀 HSP90 與窖蛋白 1、窖蛋白 1 與 eNOS）與蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞中窖蛋白 1、 eNOS 的蛋白表達(dá)（樣本數(shù)為 3），采用免疫熒光雙重染色法評估細(xì)胞中 HSP90 與窖蛋白 1、窖蛋白 1 與 eNOS 的蛋白共定位情況。通過 HADDOCK 2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接程序?qū)训鞍?1 和 eNOS 進(jìn)行分子 對接預(yù)測。數(shù)據(jù)分析采用析因設(shè)計方差分析、單因素方差分析、LSD 法。 結(jié)果 與正常對照組相 比，單純 17-AAG 組細(xì)胞增殖水平于處理完成后培養(yǎng) 24、48、72 h 均明顯降低（P<0.01），單純負(fù)壓處理 組 細(xì) 胞 增 殖 水 平 于 處 理 完 成 后 培 養(yǎng) 24、48、72 h 均 明 顯 升 高（P<0.01）；與 單 純 17-AAG 組 相 比 ， 17-AAG+負(fù)壓處理組細(xì)胞增殖水平于處理完成后培養(yǎng) 48、72 h 均明顯升高（P<0.05 或 P<0.01）；與單 純負(fù)壓處理組相比，17-AAG+負(fù)壓處理組細(xì)胞增殖水平于處理完成后培養(yǎng) 24、48、72 h 均明顯降低 （P<0.01）。劃痕后 12 h，與正常對照組的（39.9±2.7）%相比，單純 17-AAG 組細(xì)胞遷移率明顯降低 ［（10.7±2.7）% ，P<0.01］，單 純 負(fù) 壓 處 理 組 細(xì) 胞 遷 移 率 明 顯 升 高［（61.9±2.4）% ，P<0.01］；與 單 純 17-AAG 組相比，17-AAG+負(fù)壓處理組細(xì)胞遷移率明顯升高［（37.7±3.7）%，P<0.01］；與單純負(fù)壓處理

   本實驗研究旨在探討負(fù)壓處理對人臍靜脈血 管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）新生的影響，并從 HSP90、窖 蛋白 1、eNOS 等分子水平闡明其機制，為臨床治療 慢性創(chuàng)面提供新的參考。

     討論

     在臨床中，NPWT 被廣泛應(yīng)用于皮膚移植后固 定［17］ 、皮瓣修復(fù)術(shù)后創(chuàng)面封閉［18］ 、燒傷創(chuàng)面清創(chuàng)［19］ 、 下肢軟組織重建術(shù)后創(chuàng)面封閉［20］ ，同時也是下肢靜 脈性潰瘍創(chuàng)面［21?22］ 、糖尿病足潰瘍［23?24］ 、壓瘡［25］ 、術(shù)后 切口愈合不良［26］ 等難愈性創(chuàng)面的重要治療手段。 但是，目前對于 NPWT 在創(chuàng)面愈合中的作用及其機 制尚缺乏全面的認(rèn)知。體外負(fù)壓梯度模擬機可以 對體外培養(yǎng)的細(xì)胞施加負(fù)壓作用，從而有助于深入 研究負(fù)壓促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機制。因此，本課題組自 行設(shè)計研發(fā)全自動三維細(xì)胞梯度負(fù)壓加載裝置，并 基于此構(gòu)建 NPWT 在細(xì)胞中應(yīng)用的離體模型。本課 題 組 先 進(jìn) 行 了 SD 大 鼠 全 層 皮 膚 缺 損 創(chuàng) 面 應(yīng) 用 NPWT 的預(yù)實驗，結(jié)合數(shù)字散斑技術(shù)，獲取負(fù)壓值與 創(chuàng)面位移量化所得形變量的對應(yīng)關(guān)系，在此基礎(chǔ) 上，設(shè)計體外細(xì)胞負(fù)壓加載裝置，通過激光測距裝 置轉(zhuǎn)換并且控制壓力。