激光掃描共聚焦顯微鏡（K1-Fluo）在光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上結(jié)合了激光和計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)，把光學(xué)顯微鏡的分辨率提高了30-40%，其光學(xué)切片能使觀察組織，細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)成為可能。本文著重介紹了共聚焦顯微鏡在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，樣品的三維定量測(cè)量，活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)信號(hào)監(jiān)測(cè)并探討了激光共聚焦顯微鏡子啊生物學(xué)的應(yīng)用前景。

與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡(K1-Fluo)能提供高清晰的三維圖像，在材料學(xué)（半導(dǎo)體工業(yè)），地質(zhì)學(xué)，醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

生物用共聚焦顯微鏡大多是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上,以紫外線可見(jiàn)激光激發(fā)熒光物質(zhì),得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。不同的結(jié)構(gòu)有各自性的滎光染料 ,有些甚至可以在活細(xì)胞上非創(chuàng)傷性地進(jìn)行染色,在亞細(xì)胞水平上觀察諸如 CapH、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化 ,特別是在結(jié)合了先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)以后,更成為藥理學(xué)，形態(tài)學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，研究中強(qiáng)有力的新一代研究工具。下文引述的共聚焦顯微鏡均以生物用熒光共聚焦顯微鏡為例。

2.傳統(tǒng)熒光顯微鏡的不足

使用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu),不僅圖像與背景的對(duì)比度增強(qiáng).而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光,大大提高了分辨率(8=0.61 入/NA其中6為顯微鏡的分辨率入為照明光線的波長(zhǎng) ;NA 為物鏡的數(shù)值孔徑)。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí),傳統(tǒng)光顯微鏡一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)就顯現(xiàn)出來(lái):焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)(如耳蝸基底膜.其實(shí)是外毛細(xì)胞、多種支持細(xì)胞神經(jīng)纖維等組成的空間結(jié)構(gòu)).在普通光學(xué)顯微鏡下聚焦平面的變化,會(huì)表現(xiàn)出不同的形態(tài)。假若熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在不同層次上都有分布,且重疊在一起反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量而且來(lái)自焦平面上方 或下方的散射熒光也被物鏡所接收.熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率就要大大降低。

3. 共聚焦顯微鏡的成像原理及技術(shù)

共聚焦顯微鏡成功地解決了上述問(wèn)題，只有焦平面上的點(diǎn)才得到探測(cè)。它采用點(diǎn)光源(point lightsource)照射標(biāo)本,在焦平面上形成了一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)(light spot),該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器(beam splitter)。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔(pinhole).分別稱(chēng)為照明針孔和探測(cè)針孔。二者的幾何尺寸一致,約 0.1~0.2m;相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)。二者是共輒的,即:光點(diǎn)通過(guò)一系列的透鏡 最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。

這樣,來(lái)自焦平面的光,可以會(huì)聚在探測(cè)針孔范圍之內(nèi),而其它來(lái)自焦平面上方或下方的散射光,都被擋在探測(cè)針孔之外而不能成象。以激光逐點(diǎn)掃描樣品,探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像,轉(zhuǎn)為為數(shù)字量傳輸至計(jì)算機(jī) 最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面,這個(gè)光學(xué)橫斷面總是有一定厚度的,又稱(chēng)之為光學(xué)薄片(Optical slice)。共聚焦顯微鏡光學(xué)分辨率及其光學(xué)薄片厚度,與光的波長(zhǎng)有關(guān),也取決于物鏡的數(shù)值孔徑和針孔的直徑。如果探測(cè)器的針孔較大,光學(xué)薄片即變得較厚,那么所獲得的圖像與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡無(wú)異。

以一個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達(dá)(最小步距可達(dá) 0.1m)控制載物臺(tái)的升降使焦平面依次位于標(biāo)本的不同層面上,則可以逐層獲得物體光學(xué)橫斷面的圖像,這稱(chēng)為“光學(xué)切片”(Optical sectioning)。獲得真正意義上的標(biāo)本的三維數(shù)據(jù),可以利用多種計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件,沿 xy 軸或其它任意角度來(lái)表現(xiàn)標(biāo)本的外形剖面,十分靈活、直觀進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

4. 共聚焦顯微鏡地生物學(xué)應(yīng)用

4.1 細(xì)胞，組織的三維觀察和定量測(cè)量

掃描電鏡已在觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的三維圖像方面獲得極大的成功,其分辨率是光鏡(包括共聚焦顯微鏡)所不可比擬的。但其樣本的制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜,所需的設(shè)備條件要求較高,并可能造成某些結(jié)構(gòu)的缺失或改變。共聚焦顯微鏡的分辨率超過(guò)普通光鏡.染色過(guò)程簡(jiǎn)便.甚至可以在活細(xì)胞上進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性的染色,維持細(xì)胞的正常形態(tài)。多種特異性的熒光染料 如AO (Acridine orange)、PI (Propidium iodide)、DAPI, Rhodamine、鬼筆毒環(huán)肽(Phalloidin)和DiI等,已被廣泛地用于諸如 RNA,DNA細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。運(yùn)用免疫熒光技術(shù),將不同波長(zhǎng) 的兩三種熒光物質(zhì)標(biāo)記在內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)的相應(yīng)抗體上,以這幾種熒光物質(zhì)特定的光譜特性選擇激發(fā)光和濾光片 ,則可以觀察到細(xì)胞內(nèi)部各結(jié)構(gòu)的間毗鄰關(guān)系。特別是在熒光著色點(diǎn)較小易被遮蓋(如熒光原位雜交實(shí)驗(yàn))的情況下,這種三維圖像的多角度觀察提供了極大的*性

細(xì)胞有絲分裂中細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目(雙倍體、多倍體)、形態(tài)和位置的變化.一直是細(xì)胞生物學(xué)腫瘤研究中的熱點(diǎn)。著絲點(diǎn)是細(xì)胞核內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在有絲分裂中起重要的作用,應(yīng)用共聚焦顯微鏡的定量測(cè)量技術(shù),可以較精確地測(cè)定著絲點(diǎn)在不同分裂期的位置。

共聚焦顯微鏡生成厚度小于 0.2 微米的依次相連的光學(xué)切片 .使較厚的組織的三維數(shù)據(jù)也可被計(jì)算機(jī)獲取,運(yùn)用適當(dāng)?shù)膱D像分析軟件 .可以測(cè)量并確定所觀察結(jié)構(gòu)的表面特征,體積等參數(shù),為三維定量測(cè)量提供了新手段。

4.2 活細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

活細(xì)胞的功能監(jiān)測(cè)在細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域都有重要意義。許多熒光染料可以聚集在細(xì)胞的特定結(jié)構(gòu),而對(duì)細(xì)胞的活性基本上不產(chǎn)生影響?？梢岳眠@一特性來(lái)反映細(xì)胞受到刺激后形態(tài)或功能的改變。如親脂性染料 DiOC6主要聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER),且對(duì)細(xì)胞的毒副作用極小。肌細(xì)胞中的肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum,SR)與 ER 有相同的屬性,是胞內(nèi)鈣庫(kù),應(yīng)用共聚焦顯微鏡,就可以動(dòng)態(tài)觀察肌細(xì)胞興奮時(shí) SR 的變化。

神經(jīng)生理學(xué)家多年來(lái)一直期望能直接用肉眼觀察到神經(jīng)通路的興奮傳導(dǎo),應(yīng)用共聚焦顯微鏡就可觀察用電壓敏感性染料或離子敏感性染料著色的腦片深層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膫鲗?dǎo)或與其伴隨的離子的進(jìn)出。從而為神經(jīng)回路、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究提供了第一手的資料。

總之.共聚焦顯微鏡利用熒光染料,從形態(tài)和功能兩個(gè)方面為生物學(xué)研究提供了嶄新技術(shù)手段。

5. 共聚焦顯微鏡的未來(lái)-激光細(xì)胞儀

共聚焦顯微鏡是以激光作為光源的，利用紫外或可見(jiàn)激光的生物學(xué)效能，可以進(jìn)一步發(fā)展成激光細(xì)胞儀。

5.1 粘附細(xì)胞的分選

流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)游離細(xì)胞分選，如鑒別出二倍體和多倍體細(xì)胞。激光細(xì)胞儀則可能對(duì)貼附在培養(yǎng)皿底部的粘附細(xì)胞進(jìn)行分選。將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特質(zhì)培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿底部有一層特殊的膜,用高能量激光在欲選細(xì)胞四周切割成八角形幾何形狀.掀去培養(yǎng)皿底部的膜.非選擇細(xì)胞則被去除。該分選方式特別適用于選擇數(shù)量極少的細(xì)胞.諸如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)化或雜交癌細(xì)胞。另一種細(xì)胞分選的方式是用高能量激光自動(dòng)殺滅不需要細(xì)胞留下完整的活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng),這種方式適于對(duì)數(shù)量較多的細(xì)胞的選擇。

5.2 細(xì)胞激光顯微外科

可把激光作為一把“光子刀”，實(shí)現(xiàn)諸如細(xì)胞膜瞬間穿孔，線粒體或溶酶體等細(xì)胞器燒灼，染色體切割，神經(jīng)元凸起切除等一系列細(xì)胞“外科手術(shù)”。

5.3 光鑷

光鑷是利用激光的力學(xué)效應(yīng),將一個(gè)微米級(jí)大小的細(xì)胞器或其它結(jié)構(gòu)鉗制于激光束的焦平面上,也稱(chēng)為光陷阱(optical trap)。其原理,激光從上方進(jìn)入顯微鏡的物鏡.光束內(nèi)聚在焦平面上形成光束狹部(beam waist),產(chǎn)生三維的光強(qiáng)梯度個(gè)微米級(jí)的物體就可被陷阱捕獲。顯微鏡的照明光線來(lái)自下方的聚光器

光鑷可以用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞融合(如卵細(xì)胞受精)、機(jī)械刺激或細(xì)胞骨架彈性測(cè)量等.特別是在測(cè)量植物細(xì)胞的細(xì)胞骨架時(shí)很有意義),因?yàn)橹参镉幸粚雍裼驳募?xì)胞壁,不能像動(dòng)物細(xì)胞那樣利用微操縱器對(duì)原生質(zhì)膜進(jìn)行機(jī)械處理。

5.4 籠鎖化合物

現(xiàn)在許多重要的生物活性物質(zhì)(神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)第二信使)都有其籠鎖化合物合成)，如 Ca2的籠鎖化合物)主要有 Nitr - 5,DM -nitrophen。在籠鎖(caged)狀態(tài)下,其功能被封閉,一旦被特異波長(zhǎng)(一般為紫外)的瞬間照射后.即被光活化而解籠鎖(uncaged),快速地恢復(fù)原有的活性和功能。這種方法提供了一種在時(shí)間和空間上可控的生物活性產(chǎn)物或其它化合物釋放的有效方法。

5.5 光漂白后的熒光恢復(fù)

FRAP 技術(shù)借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域,從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅,該區(qū)域周?chē)奈创銣绲臒晒夥肿訉⒁砸欢ㄋ俾氏蚴苷諈^(qū)域擴(kuò)散,而此擴(kuò)散速率可通過(guò)低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)。在研究細(xì)胞骨架構(gòu)成、跨膜大分子遷移率細(xì)胞膜流動(dòng)性、胞間通訊等領(lǐng)域中有較大的意義

6. 結(jié)語(yǔ)

共聚焦顯微鏡對(duì)光學(xué)顯微鏡的成像原理作了改進(jìn)，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的三維觀察和測(cè)量，同時(shí)又可以監(jiān)測(cè)許多生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，特別是結(jié)合激光生物學(xué)的研究手段，在整個(gè)生物學(xué)研究領(lǐng)域都有著廣闊的前景。