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細(xì)胞轉(zhuǎn)染成敗的原因分析
細(xì)胞轉(zhuǎn)染成敗的原因分析
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轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無(wú)論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。
1、載體DNA
總則：對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照。
·載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來(lái)自于儲(chǔ)存和處理過(guò)程中的物理壓力的影響。
·載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物（如CsCl，內(nèi)毒素）可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
·載體構(gòu)造（啟動(dòng)子/增強(qiáng)子/ORI）——轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件（如，RSV，CMV，和SV40）的對(duì)照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子體系的相對(duì)有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可表達(dá)large T抗原（如，COS）；而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。
除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。
2、細(xì)胞
·貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對(duì)于貼壁細(xì)胞（如HEK，CHO），懸浮細(xì)胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒(méi)有分子水平上合理機(jī)制的解釋。
·分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過(guò)度生長(zhǎng)的狀態(tài)；此外，還常用促有絲分裂刺激物（如，病毒轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞）來(lái)活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。
·分板方案——在對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分板傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化時(shí)間的長(zhǎng)短，胰蛋白酶的滅活等）需要優(yōu)化。
·傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對(duì)一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度（通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)）。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)也可能會(huì)有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們*復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。
·細(xì)胞數(shù)量（融合率）——只要培養(yǎng)基質(zhì)（組織培養(yǎng)皿）尚有空間，細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對(duì)于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度受細(xì)胞密度大小的抑制（接觸抑制），但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)并可互相疊加。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞會(huì)因受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及細(xì)胞溶解之前的生長(zhǎng)情況相關(guān)。
·培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。
·支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%，它可改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對(duì)采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無(wú)法通過(guò)視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過(guò)大多數(shù)的無(wú)菌濾膜；它們還對(duì)常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。
3、交叉污染
如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循zui嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過(guò)后它們就會(huì)*取代目標(biāo)培養(yǎng)物。
4、組織培養(yǎng)試劑
一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。
·基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸，葡萄糖），維生素，無(wú)機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存；因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。
·胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長(zhǎng)促進(jìn)因子和生長(zhǎng)抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營(yíng)養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。
·添加劑——某些細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于一些對(duì)生命力或細(xì)胞分裂*的物質(zhì)（如，生長(zhǎng)因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等）。
·CO2培養(yǎng)箱——細(xì)胞生長(zhǎng)所需環(huán)境為37℃、相對(duì)濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值，細(xì)胞生理對(duì)pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來(lái)有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對(duì)一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致（溫度、濕度和CO2）則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異。來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理。
5、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的*步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來(lái)幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。
一旦選好了質(zhì)粒載體，無(wú)論瞬時(shí)或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維持對(duì)細(xì)胞的選擇壓力。
6、轉(zhuǎn)染方案
一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案；首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過(guò)改變?cè)噭?DNA的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化。
·轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)?？捎脽o(wú)菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說(shuō)明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物；如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的*孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對(duì)于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。
轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比（負(fù)載比）——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)zui有效。有時(shí)候這種*配比的所在范圍非常狹窄；對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到*配比。
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