問題

未檢測(cè)到分析物。

原因/補(bǔ)救措施

• 檢查使用的蛋白質(zhì)量：布拉德福德測(cè)試;
  支鏈氨基酸法

• 增加蛋白質(zhì)濃度

• 如果可能，使用抗原表達(dá)水平高的陽性對(duì)照

• 使用新鮮的裂解緩沖液

• 向樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑

• 將樣品儲(chǔ)存在冰上 （4°C）

分析物在電泳過程中用完凝膠

• 使用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)確保目標(biāo)蛋白質(zhì)（kDa）仍在凝膠內(nèi)。

• 縮短電泳時(shí)間

無需從凝膠轉(zhuǎn)移到膜

• 檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否成功：麗春紅S染色

• 使用上樣對(duì)照（管家）來確保蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移相等。

• 延長(zhǎng)傳輸時(shí)間

錯(cuò)誤的印跡膜

聚偏氟乙烯

• 需要用甲醇活化

• 高結(jié)合能力（170 雙 200 μg/cm2）

• 與硝酸纖維素膜相比，更多背景

• 適用于剝離緩沖液和重新探測(cè)。

硝基細(xì)胞使用

• 結(jié)合能力低（80 雙 100 μg/cm2）

• 更少的背景

為您的樣品選擇合適的孔徑：

• 0.1， 0.2 或 0.45μm.（0.45μm孔徑適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)（≥20kDa））

轉(zhuǎn)移條件

• 轉(zhuǎn)印前去除凝膠和印跡膜之間的任何氣泡。

• 減少傳輸時(shí)間和/或電流（“過度傳輸”）。

阻止持續(xù)時(shí)間

縮短阻塞持續(xù)時(shí)間

• 室溫下1h

封閉劑的選擇

抗原掩膜

• 使用較低的濃度

• 使用其他緩沖區(qū)

我們建議使用來自同一物種的5%正常血清作為二抗或不含IgG的BSA。

強(qiáng)力洗滌

• 減少洗滌步驟的次數(shù)和/或持續(xù)時(shí)間

• 3x 5 分鐘（室溫）

• 降低洗滌劑的濃度

• 0.1-0.5% 吐溫 20

一抗錯(cuò)誤

確保您選擇的抗體適用于蛋白質(zhì)免疫印跡（數(shù)據(jù)表）

孵育時(shí)間（一抗）

延長(zhǎng)孵育時(shí)間

• 4°C 過夜

抗體濃度低

• 檢查使用的抗體濃度。

• 驗(yàn)證相關(guān)性

• 從數(shù)據(jù)表中所述的較高濃度開始。然后逐步降低注意力。

二抗錯(cuò)誤

檢查二抗是否與所選的一抗結(jié)合（數(shù)據(jù)表）

辣根過氧化物酶（HRP）活性受到抑制

• 不要在緩沖液中使用疊氮Hua鈉。因?yàn)樗种艸RP（辣根過氧化物酶）偶聯(lián)活性。

• 不要使用甘油與ACS等級(jí)低于99，5%。因?yàn)樗种艸RP（辣根過氧化物酶）偶聯(lián)活性。

• 避免反復(fù)冷凍和解凍抗體溶液。

• 準(zhǔn)備小等分試樣

抗體儲(chǔ)存技巧

ECL試劑已過期

使用新鮮的ECL試劑

ECL試劑污染

使用新鮮的ECL試劑

曝光時(shí)間

• 根據(jù)抗原表達(dá)水平的不同，暴露時(shí)間可能會(huì)有所不同

• 通過小步驟增加暴露時(shí)間

問題

原因/補(bǔ)救措施

高抗原表達(dá)水平

降低蛋白質(zhì)濃度

封閉劑的選擇

• 如果需要檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)，請(qǐng)勿使用奶粉。

• 一抗可能與酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)

• 如果使用鏈霉親和素/親和素偶聯(lián)物，請(qǐng)勿使用奶粉。

• 牛奶含有內(nèi)源性生物素

• BSA和奶粉不適用于檢測(cè)山羊、牛或綿羊的二抗。

• 二抗可能與來自BSA或奶粉的牛免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)

我們建議使用來自同一物種的5%正常血清作為二抗或不含IgG的BSA。

孵育時(shí)間（封閉試劑）

延長(zhǎng)孵育時(shí)間

• 室溫下1h

一抗?jié)舛儒e(cuò)誤

• 降低一抗?jié)舛?/p>

• 滴定

二抗?jié)舛儒e(cuò)誤

• 降低二抗?jié)舛?/p>

• 滴定

洗滌

曝光時(shí)間

• 增加洗滌步驟的數(shù)量和/或持續(xù)時(shí)間

• 3 x 5分鐘 – 5 x 5分鐘

• 將吐溫 20 添加到洗滌緩沖液中

• (0.1-0.5%)

• 使用振動(dòng)篩

根據(jù)抗原表達(dá)水平的不同，暴露時(shí)間可能會(huì)有所不同

轉(zhuǎn)印膜

• 處理膜時(shí)使用鑷子

• 膜不應(yīng)變干

檢測(cè)試劑

降低底物濃度

問題

原因/補(bǔ)救措施

蛋白質(zhì)被 降解

• 使用新鮮的裂解物

• 將樣品儲(chǔ)存在冰上 （4°C）

• 將蛋白酶抑制劑添加到樣品緩沖液中

樣品條件

• 檢測(cè)到錯(cuò)誤的亞型

• 翻譯后修飾

• 分子量變化，可能導(dǎo)致雙條帶

• 如果可能，使用陽性對(duì)照

• 如果可能，使用陰性對(duì)照

• 樣品和/或緩沖液的細(xì)菌污染

• 準(zhǔn)備新鮮樣品或緩沖液

• 使用去離子水

轉(zhuǎn)印膜

• 轉(zhuǎn)印前去除凝膠和印跡膜之間的任何氣泡。

• 在封閉之前快速清洗膜，以去除任何殘留的凝膠或SDS。

一抗

• 驗(yàn)證一抗的特異性結(jié)合

• 在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中使用不含一抗的二抗。

• 優(yōu)化抗體濃度（滴定）。