1.  方法驗證

分析方法驗證是證明分析程序適合其預(yù)期目的的過程⁵。并非所有驗證特征都適用于粒度分析。較早的 FDA 工業(yè)指南（非實施）草案文7包括一個專門針對粒度分析的部分。盡管較新的已發(fā)布文件取代了較舊的指南草案，但有關(guān)粒度分析的較舊部分提供了有關(guān)粒度分析與其他技術(shù)（如 HPLC）的不同之處的見解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗證工作：

“方法驗證通常涉及中間精度和重復(fù)性的評估。應(yīng)保證生成的數(shù)據(jù)是可重復(fù)的，并控制產(chǎn)品的質(zhì)量?！?sup>7

考慮到這一評論，下面提供了解決 DLS 方法驗證的建議：

● 特異性：N/A，DLS 檢測大小變化但對不同化學(xué)物質(zhì)不敏感。

● 線性：N/A，DLS 沒有任何線性關(guān)系。

● 準確性：N/A，儀器的準確性使用標準粒子進行驗證，但常規(guī)定量裁判方法（SEM/TEM 顯微鏡）不包括準確性確定。包括樣品的 SEM/TEM 圖像以支持方法驗證可能是更合適的。

● 精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）：這是需要重點關(guān)注的地方。通常這些術(shù)語的定義在粒度分析領(lǐng)域可能不同于其他技術(shù)。以下評論來自粒度分析領(lǐng)域：

    重復(fù)性：多次測量樣品。

    重現(xiàn)性：準備樣品、測量、丟棄、清潔、重復(fù)。建議的方法是制備五份樣品，然后對每個樣品進行五次分析。

    中間精密度：此活動涉及第二位分析員、第二臺儀器或兩者兼而有之。如果所有測試都在一個地點進行，則由同一系統(tǒng)上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個地點進行測試，則同一樣本（或批次）由不同操作員在不同地點的不同系統(tǒng)上進行分析。

● 范圍：N/A，僅在所用系統(tǒng)的工作范圍內(nèi)工作。無需對此進行測試或記錄。

● 定量限：N/A，這只是測試粒徑。

● 檢測限：N/A，方法開發(fā)應(yīng)確保樣品在系統(tǒng)檢測限內(nèi)。

2.  結(jié)構(gòu)示例

兩名操作員在兩個 Nicomp DLS 系統(tǒng)上分析了一種藥物物質(zhì)（異丙酚乳劑）。該樣品已過期，但仍顯示符合 USP<729>的合格結(jié)果。儀器設(shè)置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3.  方法開發(fā)

首先分析 92 nm PSL 標準以確保適當?shù)南到y(tǒng)性能。測量結(jié)果在預(yù)期值的 98% 以內(nèi)。建議在開始此類工作之前進行此驗證測試。

接下來進行快速研究以測試濃度（稀釋）的影響。參見圖 1 中的結(jié)果。

遵循這些指南的內(nèi)容，DLS 規(guī)格（根據(jù)定義尺寸小于 10 µm）對于強度平均值可以是可重復(fù)的 ±20%，對于 PI 或其他計算結(jié)果指示分布寬度是可重復(fù)的 ±30%。對于某些藥品，這可能是一個可以接受的范圍，但要注意當粒徑非常小時出現(xiàn)的統(tǒng)計問題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯。但對于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì)，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。

將 10 滴樣品加入 15 mL 去離子水中并進行分析。重復(fù)相同的制備。然后將這些樣品按 2:1 稀釋并進行分析。樣品看起來太渾濁，結(jié)果發(fā)生變化，因此將下一滴添加到 15 mL DI 水中。樣品出現(xiàn)輕微混濁，這些結(jié)果是可以接受的。有時，稀鹽溶液是比純?nèi)ルx子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入 10 mL 過濾后的 10 mM KCl 溶液中。這些結(jié)果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他測量。

在進行稀釋研究時，分析時間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時間的時間曲線圖如圖2-4所示。紅色=光強粒徑平均值，藍色=體積粒徑平均值，藍色=數(shù)量粒徑平均值。

該方法選擇了5分鐘的分析時間。在五分鐘的分析時間完成之前，光強平均粒徑結(jié)果已經(jīng)穩(wěn)定下來。但直到大約9分鐘前，體積和數(shù)量加權(quán)平均結(jié)果仍在變化。這是也是在使用DLS時僅選擇光強粒徑結(jié)果的一個原因。這可能是方法開發(fā)中測試重復(fù)性很好的一個點。在這種情況下，也許下一個測試的分析時間是四分半、五分和五分半鐘。在這項研究中沒有執(zhí)行這一步驟，值得指出的是，整個方法開發(fā)和驗證研究在不到8個小時內(nèi)完成。更嚴格的最終發(fā)布測試方法開發(fā)和驗證方法很可能需要至少幾天時間。

4.  樣品準備

——在干凈的瓶子里裝滿10毫升過濾后的KCl溶液

——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚

——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋轉(zhuǎn)直到混合(10秒)

——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池

——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開樣品蓋

——將樣品池和支架插入Nicomp系統(tǒng)，Holder支架背向Nicomp的左側(cè)

——關(guān)閉Nicomp上的樣品蓋

確保儀器設(shè)置與如下所示的值匹配：

——單擊綠色“G”圖標開始測量

——打印并記錄平均直徑、標準偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——將結(jié)果輸入 Excel 電子表格

——計算五項分析的平均值和變異系數(shù)

——比較兩個數(shù)據(jù)集

5.  結(jié)果

樣品在 A 和 B 系統(tǒng)上獨立制備和分析。每個樣品分析五次以檢查重復(fù)性。這兩個系統(tǒng)的示例結(jié)果如圖 5 和圖 6 所示。

整個結(jié)果以表格形式顯示在圖 7 和圖 8 中。五個結(jié)果的疊加如圖所示。

6.  結(jié)論

查看綜合結(jié)果可以得出以下幾點觀察結(jié)果：

——即使是相隔數(shù)年生產(chǎn)的兩個系統(tǒng)也會生成相似的數(shù)據(jù)

——兩個系統(tǒng)之間存在明顯的 3% 偏差

——PI計算可能不是用于定義寬度分布的最佳值

——如果使用PI，則30%的差值似乎是合適的

——D10、D50、D90 結(jié)果顯示出更好的重現(xiàn)性，可能更容易為制藥行業(yè)所接受

純粹基于該數(shù)據(jù)集，基于三個測量的該藥物產(chǎn)品的規(guī)格可能類似于：

——光強平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建議規(guī)格僅來自觀察到的重現(xiàn)性，可能對藥物安全性或有效性沒有任何影響。USP<729>中的實際是否通過標準的要求只是粒徑尺寸必須低于 500 nm 并且具有低x2值。質(zhì)量標準的另一種方法可能是關(guān)注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術(shù)說明收集的數(shù)據(jù)是讓您了解 DLS 技術(shù)對于簡單樣品的可重復(fù)性/重現(xiàn)性

7.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation