干貨分享 | SNP研究中，你一定遇到過這些問題，附解答！
SNP作為第三代分子標記，其應用非常廣泛，在農業(yè)領域中，可以進行性狀基因的精細定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等；在醫(yī)學領域中，可用于疾病的分子遺傳機制研究、疾病基因定位、藥物敏感或疾病易感性位點篩選等，生命科學研究的方方面面，都與之相關。
SNP的研究主要分為SNP的發(fā)現(xiàn)及SNP的基因分型。SNP的發(fā)現(xiàn)是應用的基礎，而SNP的基因分型是應用的技術手段。新SNP通常是基于測序技術，利用已有數(shù)據(jù)庫，對多個樣本進行重測序發(fā)現(xiàn)的，但需要進行其他方法的驗證；而已知SNP的基因分型可以通過芯片技術來篩選與表型相關的SNP，從中優(yōu)選出多態(tài)性高，均勻分布的少量SNP，這些少量的SNP可以在大量樣本中進行檢測，根據(jù)樣本情況、SNP數(shù)量、試驗設計等選擇合適的方法學。前段時間，小編和大家一起了解了SNP分型檢測的幾種常用方法、原理以及在不同領域的應用情況等，近期小編也收集到部分小伙伴關于SNP的問題，整理如下，方便大家進一步對一些細節(jié)性問題進行了解哦。
想了解SNP就得先了解什么是DNA的多態(tài)性。人與人之間絕大部分的DNA序列是一樣的，DNA的多態(tài)性是指正常人群中，DNA分子或基因的某些位點可以發(fā)生改變，使DNA的一級結構各不相同，但并不影響基因的表達，形成多態(tài)；DNA的多態(tài)性可以看作是在分子水平上的個體區(qū)別的遺傳標志。DNA多態(tài)性主要表現(xiàn)為反應限制性酶切位點變化的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、反應重復單位拷貝數(shù)差異的串聯(lián)重復序列多態(tài)性，以及反應點突變的單核苷酸多態(tài)性（SNP）等。
為什么說SNP是二等位基因系統(tǒng)，而不像RFLP和SSR是多等位基因系統(tǒng)？單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，即在群體中，基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，并且其出現(xiàn)的頻率大于1%。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition嘧啶和嘧啶之間或者嘌呤和嘌呤之間的交換）或顛換（transversion嘧啶和嘌呤之間的交換）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。SNP 在CG 序列上出現(xiàn)較為頻繁，由于CG 中C 即胞嘧啶常被甲基化，自發(fā)脫氨后即變?yōu)樾叵汆奏，因此大多數(shù)情況下，都是發(fā)生的C→T的轉換，而變成A和G的概率很小，所以一般認為SNP是二等位的，或者是二態(tài)性，即一個堿基只會突變?yōu)榱硪环N堿基，而不會同時突變?yōu)榱硗舛喾N堿基。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs只需要＋／－的分析，而不用分析片段的長度，也讓其應用更為廣泛。
SNP是單堿基多態(tài)性，是一個群體概念，這個差異占群體的1%以上。若germline mutation頻率<1%，則認為是一個點突變。SNP是各種生物都有的，通過同源基因比對獲得的，一般不會發(fā)生變化，而點突變只對單一基因而言，所以從數(shù)量上SNP比點突變多得多。如果突變發(fā)生在生殖細胞，則可以遺傳，但是只要這個突變群沒有達到總群體的1%，它就只有一個突變株/系，達到了1%就是多態(tài)性了。
SNV，即單核苷酸位點變異（single nucleotide variants），SNP，即單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism)，這兩個概念都是指單核苷酸的改變，只不過SNP一般是二態(tài)的，而SNV沒有這樣的限制。另外，如果只是在病人體內檢測到單個核苷酸的變異，而其在人群中出現(xiàn)的頻率未知，則可看作SNV。
分子標記（Molecular Markers）是以個體間遺傳物質即核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。根據(jù)分子標記檢測的原理、技術手段以及通量效率，一般將分子標記分為三大類，分別是基于分子雜交技術的第一代分子標記、基于PCR技術的第二代分子標記以及基于測序技術的第三代分子標記。不同的分子標記技術如圖1 所示。
最典型的代表類型如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），是以Southern雜交為核心設計。限制性片段長度多態(tài)性是指同種生物不同個體間DNA 序列產(chǎn)生差異，形成可被限制性內切酶識別的序列進而可被消化，被消化后的產(chǎn)物由于長度不同可通過電泳進行分型，RFLP操作簡單、成本低廉，從而使RFLP被選為人類基因組計劃的第一代遺傳標記，用于基因圖譜繪制、DNA指紋分析、疾病易感性分析、基因診斷、親權鑒定等。包括隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD），擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡單序列重復標記（SSR）等，也有學者僅將微衛(wèi)星作為第二代分子標記代表，即短串聯(lián)重復序列（STR）或簡單重復序列（SSR），一般由2-6個核苷酸組成，是廣泛分布在真核生物基因組中的簡單重復序列。它具有多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等特點，因此是一種十分理想的分子標記，在遺傳圖譜構建、數(shù)量性狀位點（QTL）定位、標記輔助選擇、遺傳檢測等領域都有著重要的應用價值。隨著DNA測序技術的發(fā)展，以單核苷酸多態(tài)性（SNP）為代表的第三代分子標記迅速發(fā)展成為主流，SNP在所有生物的基因組中含量豐富，突變率較低，且獲取的成本低，因此被廣泛用于遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳和疾病相關基因的研究中。第1-3代分子標記中幾種代表性的標記類型的特點如表1所示。
表1.第1-3代標記中幾種代表性的DNA分子標記的特點
具有高的多態(tài)性，較高的多態(tài)水平和樣本量，有利于在試驗中檢測出個體間的差異，差異性越大，越能體現(xiàn)出優(yōu)勢基因和優(yōu)勢基因型；
共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；
除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；
容易獲得且可快速分析，檢測手段便于實現(xiàn)自動化；
開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；
在實驗室內和實驗室間重復性好（便于數(shù)據(jù)交換）。
SNP在基因組內的形式有哪些，都會對生物表型有影響嗎？在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，有三類：位于基因周邊的SNPs(pSNPs)，位于基因間的SNPs(iSNPs)，以及位于編碼區(qū)內的SNP(codingSNP，cSNP)。
位于編碼區(qū)內的SNP（cSNP）比較少，但由于它發(fā)生在編碼區(qū)內，在遺傳性疾病研究中具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。
位于非編碼區(qū)域的SNP又可細分為兩類，內含子中SNP對個基因功能的影響相對較小，主要依靠影響剪切位點活性來影響翻譯，從而基因功能。而基因調控區(qū)域包含啟動子區(qū)域、增強子區(qū)域等等，這些區(qū)域含有很多基因表達調控元件，這些位點的SNP發(fā)生變化，就會導致與調控因子的結合能力發(fā)生改變，從而影響正常的基因表達。
由美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、dbSNP 數(shù)據(jù)庫制定的 SNP 命名體系，rs 體系的 SNP 代表已獲得認可和推薦的參考 SNP（reference SNP），ss 體系的 SNP 代表用戶新遞交但尚未得到認可的 SNP（submitted SNP）。對于新發(fā)現(xiàn)的SNP位點，需要判斷這些SNP位點是否已知。如果該SNP位點是前人報道，需要查找rs號和引用參考文獻，如果為新發(fā)現(xiàn)的位點則需要將該位點遞交到NCBI上，獲得ss號。
SNPedia是一個SNP百科全書類網(wǎng)站，它引用已經(jīng)發(fā)布的文章或者數(shù)據(jù)庫信息，對SNP位點進行描述，共享著人類基因組變異的信息。我們可以搜索某個SNP位點來尋找與之相關的信息，也可以根據(jù)相關疾病和癥狀來尋找相關的SNP（圖2）。
圖2.SNPedia首頁
- 如果是單基因遺傳，特別是罕見遺傳的疾病，可以通過外顯子測序對一個家系的幾個個體進行測序，篩選低頻突變，隨后找到能改變蛋白功能的突變，最后做共分離分析。
- 如果是多基因病或者質量性狀定位，那么2個方法，一是全基因組關聯(lián)分析GWAS，用散發(fā)型個體，進行關聯(lián)分析，不過這種方法要的樣本量比較大，一般都要好幾百至好幾千個樣本。二是基因家系的連鎖分析，這個主要是定位，然后在后續(xù)做一些東西，一般用芯片或者全基因組重測序或者簡化基因組測序。
- 通過參考資料鎖定研究相關的基因，通過數(shù)據(jù)庫查到基因內部的 SNP 位點。
- 查找相關的參考文獻，找到研究相關的 SNP 位點。
進行SNP位點驗證，采用對照組和實驗組的大量樣本，驗證目標SNP位點SNaPshot 法：基于多重PCR和ABI 3730xl 測序平臺的 SNP 分型檢測；
直接測序法：基于一代測序平臺的SNP分型檢測；
質譜法：基于Sequenom平臺的SNP分型檢測；
Taqman探針法：基于熒光定量PCR儀平臺的SNP分型檢測，等等。
根據(jù)已有的對照組和實驗組的SNP分型結果與實驗目的進行關聯(lián)分析，如與疾病的關聯(lián)分析、遺傳連鎖分析、品種鑒定等ARMS PCR是基于Taq DNA聚合酶無法修復引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴增受阻的檢測方法。該方法理論上單個堿基的錯配即可阻礙PCR的擴增，但在實際檢測時，單個堿基的錯配依然可以延伸擴增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時需在3’末端倒數(shù)第2位或第3位堿基處引入一個錯配堿基，該錯配堿基與3’末端的錯配堿基共同作用，以降低非靶標序列的擴增效率。而如何設計錯配堿基可參考如下標準（圖3）：1）當3’末端是“強”錯配時（A/G或G/T）時，可以在引物中引入一個“弱”錯配（C/A或C/T）；2）當末端是“弱”錯配時，則需要在引物中引入一個“強”錯配；3）當末端是“中”錯配時（A/A，C/C，G/G，T/T）時，可以在引物中再引入一個“中”錯配。一般在3’末端倒數(shù)第三個堿基引入突變，可顯著提高特異性。
雖然有以上強弱錯配進行搭配的參考原則，但在實際產(chǎn)品開發(fā)過程中，小編還是建議把所有堿基錯配類型全部嘗試一遍，如引入錯配位置模板為C堿基，則可考慮設計A/C、T/C、C/C三種錯配進行篩選。此外理論上，3′端倒數(shù)第2或第3位錯配篩選到合適引物的概率最高，但假如這兩個位置效果都不理想，可嘗試3′端倒數(shù)第4、5位，甚至是倒數(shù)第7位。如果從3′端倒數(shù)第2位至倒數(shù)第7位全部篩選，總共要篩選18條引物，引物的條數(shù)是比較多的，但是確實位置不同可能效果也不同，具體什么位置無法保證，只能靠驗證結果來決定啦。
翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領域深耕多年，目前已開發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測通用原料，已被下游廠家應用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學、遺傳病檢測、疾病易感性研究等多個領域。
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