電轉(zhuǎn)百科指南①：如何提高電轉(zhuǎn)染效率？技術(shù)專家總結(jié)以下八點(diǎn)！

電轉(zhuǎn)百科指南②：不同細(xì)胞的電轉(zhuǎn)技巧，收藏了慢慢看！

電轉(zhuǎn)百科指南③：手把手教程來(lái)了，20種常用細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案

電轉(zhuǎn)百科指南④：每日問(wèn)候你的細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果好嗎，支原體污染要避免

本周第五期電轉(zhuǎn)百科我們將更進(jìn)一步，為大家?guī)?lái)CRISPR基因編輯的內(nèi)容，本章內(nèi)容將分為Knock-out與Knock-in上下篇，請(qǐng)繼續(xù)關(guān)注下一期的后續(xù)！

01/上篇

Knock-out

Lonza Nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于多種不同的場(chǎng)景，在不同的應(yīng)用場(chǎng)景下通常會(huì)使用DNA或RNA或蛋白進(jìn)行外源基因的遞送，以實(shí)現(xiàn)特殊的應(yīng)用需求。

以CRISPR系統(tǒng)為例，全球有大量的客戶使用Lonza Nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)開(kāi)展基于CRISPR系統(tǒng)的基因編輯相關(guān)工作并發(fā)表文章且逐年遞增。

▲ Google Scholar Search for ‘Nucleofector CRISPR’, July 2023

· 對(duì)于CRISPR的轉(zhuǎn)染，即可以通過(guò)表達(dá)Cas9的質(zhì)粒系統(tǒng)如PX458載體來(lái)實(shí)現(xiàn)“剪刀” Cas9的遞送，也可以通過(guò)Cas9 mRNA的方式在細(xì)胞質(zhì)中直接翻譯，與sgRNA形成復(fù)合物后再進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因組編輯。當(dāng)然我們也可以在轉(zhuǎn)染前提前將Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)行孵育形成RNP復(fù)合物，再通過(guò)電轉(zhuǎn)染遞送到細(xì)胞內(nèi)，直接進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因組編輯。

· 對(duì)于CRISPR應(yīng)用，主要用于knock-out或Knock-in

Knock Out：盡管Knock-out已經(jīng)比較容易實(shí)現(xiàn)高效的敲除效率，但對(duì)于陌生的細(xì)胞或者全新的位點(diǎn)依然需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。包括但不限于以下方面：

不同的Nucleofection條件測(cè)試

Lonza為多種常用的細(xì)胞提供預(yù)優(yōu)化的電轉(zhuǎn)程序，電轉(zhuǎn)程序與細(xì)胞相關(guān)，通常來(lái)說(shuō)，即使電轉(zhuǎn)不同的核酸底物(DNA，RNA，蛋白等)無(wú)需對(duì)電轉(zhuǎn)程序進(jìn)行調(diào)整，但在越來(lái)越多的原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染中，使用RNA或RNP進(jìn)行細(xì)胞基因編輯時(shí)，可以通過(guò)對(duì)程序進(jìn)行適當(dāng)?shù)奈⒄{(diào)，以獲得更高編輯效率的同時(shí)，更好的維持細(xì)胞的活率及功能。對(duì)于常見(jiàn)的T cell，HSPC，NK，DC等免疫細(xì)胞可以對(duì)Nucleofection脈沖條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同的crRNA/sgRNA測(cè)試

對(duì)于同一基因不同的sgRNA表現(xiàn)可能不同，目前已有大量設(shè)計(jì)sgRNA序列的工具，部分工具也可以為其打分，但通常還是建議盡可能測(cè)試多個(gè)sgRNA以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甚至結(jié)合多條sgRNA對(duì)同一基因進(jìn)行編輯。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同Cas9蛋白的測(cè)試

對(duì)于不同供應(yīng)商的Cas9蛋白也存在切割活性的差異，對(duì)于WT Cas9和一些經(jīng)過(guò)優(yōu)化的Cas9蛋白也會(huì)導(dǎo)致編輯效率的差異。

▲ Akiko Seki et al., 2018

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9用量測(cè)試

除對(duì)不同Cas9蛋白來(lái)源的測(cè)試外，Cas9的用量也是需要在試驗(yàn)優(yōu)化中考量的因素。

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9:sgRNA比例測(cè)試

對(duì)于Cas9蛋白和sgRNA形成的蛋白復(fù)合物，以何種比例添加進(jìn)行孵育轉(zhuǎn)染必定也是重要的因素。在大多數(shù)的出版物中，Cas9:gRNA的比值在1:1.2 - 1:5之間。

▲ Akiko Seki et al., 2018

Electroporation Enhancer

有時(shí)可以考慮使用electroporation enhancer以實(shí)現(xiàn)更高的編輯效率。

▲ Matteo Martufi et al., 2019

市面上大多數(shù)提供Cas蛋白或sgRNA的供應(yīng)商通常也會(huì)提供一份詳細(xì)的protocol，可以優(yōu)先參考這些protocol或相關(guān)的paper。除上面提到的方向外，供體差異，轉(zhuǎn)染的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞)，何種激活劑激活也可能會(huì)對(duì)最終的結(jié)果造成影響。