細(xì)胞由來：

大鼠成骨細(xì)胞分離出來開創(chuàng)骨細(xì)胞主要是由里外關(guān)節(jié)軟骨和脊髓中栽培基質(zhì)里的間充質(zhì)祖先細(xì)胞分裂而成，能非特異代謝多種多樣生理活性物質(zhì)，調(diào)整甚至影響骨的形成和復(fù)建全過程。成骨細(xì)胞是骨形成的主要作用細(xì)胞，承擔(dān)骨基質(zhì)合成、代謝和酸化。骨不斷地進(jìn)行著復(fù)建，骨重建全過程包含破骨細(xì)胞粘貼在舊骨地區(qū)，代謝堿性物質(zhì)融解礦物，代謝胰蛋白酶消化吸收骨基質(zhì)，產(chǎn)生骨吸收陷窩:之后，成骨細(xì)胞移行到被人體吸收位置，代謝骨基質(zhì)，骨基質(zhì)酸化而產(chǎn)生新骨:破骨與成骨全過程平衡是保持正常肌肉量的關(guān)鍵所在。成骨細(xì)胞塑造不僅有利于掌握骨形成體制、骨骼系統(tǒng)病癥的分子和細(xì)胞學(xué)基本，都是藥物篩選、生物技術(shù)開發(fā)與生物技術(shù)科學(xué)研究的重要途徑。

細(xì)胞專用培養(yǎng)基成分：

500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基；胎牛血清；細(xì)胞細(xì)胞生長因子；青霉素鈉/氨芐青霉素水溶液

細(xì)胞恢復(fù)：

1.在無菌區(qū)備好15ml離心管架和T-25培養(yǎng)瓶分別添加5ml培養(yǎng)液；

2.將凍存管放進(jìn)37℃恒溫水浴鍋中，握緊凍存管不斷搖晃，直至包裝物溶化。隨后馬上把凍存管從沙浴取出，擦拭并噴撒75%酒精，挪到無菌區(qū)；

3.小心翼翼地拆裝外蓋，不必遇到里邊的螺牙，用移液器輕輕地吸出來細(xì)胞懸浮液，參與到備好15ml離心管架中，1000rpm離心式5min；

4.棄上清后，清淚離心管架底端分散化細(xì)胞沉積，添加適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)到備好T25培養(yǎng)瓶（提議加液量：5~7ml）；

5.輕輕地?fù)u晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞聯(lián)合分布，如有需要（可使用悶熱瓶），松掉單流閥，便于氣體交換。

6.將培養(yǎng)瓶放進(jìn)CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

留意:1.低溫冷藏的細(xì)胞非常脆弱，請(qǐng)把凍存管放進(jìn)37℃的沙浴中解除凍結(jié)，盡早恢復(fù)細(xì)胞。2.提早室內(nèi)溫度加熱培養(yǎng)液。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)：

接到細(xì)胞后，一定要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面進(jìn)行清潔，將細(xì)胞放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行1-2小時(shí)緩存，待細(xì)胞修復(fù)基本上生長狀態(tài)后，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。

在倒置顯微鏡下觀查全部細(xì)胞生長情況：

（一）細(xì)胞未長到85%時(shí)，用75%乙醇噴撒全部瓶消毒處理放進(jìn)微生物工作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)苛無菌操作原則，開啟細(xì)胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上沒有標(biāo)明，吸掉剩下細(xì)胞培養(yǎng)液，只留下6-8ml細(xì)胞培養(yǎng)液再次塑造。

（二）細(xì)胞已爬滿（達(dá)85-95%）。就可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)際方法如下：

1.棄之細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗1-2次；

2.添加1.0ml胰蛋白酶消化酶，37℃消化吸收(消化時(shí)間針對(duì)不同細(xì)胞及常用胰蛋白酶略有不同)，高倍顯微鏡觀查細(xì)胞消化吸收狀況，若細(xì)胞收縮變園、通透、輕輕拍打甁壁呈流砂樣掉下來，則快速取回工作臺(tái)，添加翻倍的細(xì)胞培養(yǎng)液，停止消化吸收并輕輕地吹打細(xì)胞1-2次，使之變?yōu)閱渭?xì)胞懸浮液；

3.將細(xì)胞搜集于離心管架中離心式1000rmp/5min，棄上清，清淚層底，將細(xì)胞彈散；

4.添加新鮮的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，開展傳代培養(yǎng)；

5.要是沒有特別提示，提議接到細(xì)胞之后的初次傳代培養(yǎng)比例是1:2。

注：1.觀查細(xì)胞相對(duì)密度用（4X目鏡）低倍鏡觀查，便于準(zhǔn)確判斷細(xì)胞相對(duì)密度；觀查細(xì)胞形狀請(qǐng)使用（10X或20X）高倍鏡觀查；

2.應(yīng)用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化酶;

3.瓶內(nèi)運(yùn)輸細(xì)胞培養(yǎng)液不可以多次重復(fù)使用，請(qǐng)換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液塑造；

4.有一些細(xì)胞貼壁不穩(wěn)固，若發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有掉下來，可離心式重懸后注射到原瓶里。

細(xì)胞冷凍保存：

1.常規(guī)方法搜集對(duì)數(shù)期的貼壁細(xì)胞或飄浮細(xì)胞于試管嬰兒中。

2.依據(jù)塑造細(xì)胞的密度凍存管大小明確需要冷凍保存細(xì)胞數(shù)。

3.將需要數(shù)量的細(xì)胞混液放置離心管架中，1000rmp，5min離心式搜集塑造細(xì)胞沉積，棄之離心管架里的上層清液。

4.加入適量細(xì)胞凍存液于離心管架中，使細(xì)胞濃度值大約為5×105-1×107/ml。輕輕地?cái)嚢杓?xì)胞，做成細(xì)胞混合物。

5.將離心管架里的細(xì)胞混合物分開包裝于已標(biāo)識(shí)的凍存管中，建議每管1ml或1.5ml。

6.直接把分裝好的細(xì)胞凍存管放進(jìn)-80℃醫(yī)用冷藏箱中，可長期冷凍。

7.如果要液態(tài)氮中遠(yuǎn)期儲(chǔ)存，需先放入-80℃電冰箱一天時(shí)間，即可挪到液氮罐中保存。

8.之上冷凍保存步驟是依照無血清蛋白凍存液。

本文介紹了大鼠成骨細(xì)胞的來源和作用，詳細(xì)描述了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞傳代和冷凍保存的步驟和技巧，旨在幫助學(xué)習(xí)者掌握大鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用技術(shù)。