基于需要遞轉(zhuǎn)不同種類核酸/蛋白類型研究，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)，研究者們常碰到如下三類問(wèn)題：

1. 細(xì)胞對(duì)化學(xué)試劑較為敏感，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞活率下降或死亡；

2. 研究常用細(xì)胞類型較多，不同類型細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率差異較大，導(dǎo)致單個(gè)轉(zhuǎn)染試劑或者實(shí)驗(yàn)流程，無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)需求；

3. 遞轉(zhuǎn)多種類型核酸或蛋白，需要挑選對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑，并且需要大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，才可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。

有沒(méi)有一款化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑，可以同時(shí)應(yīng)對(duì)常規(guī)到難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，有著較低的細(xì)胞毒性，并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉(zhuǎn)呢？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑，可同時(shí)應(yīng)對(duì)常見(jiàn)細(xì)胞及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型，避免條件摸索和大量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，輕松得到您理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

• 已驗(yàn)證在大多數(shù)細(xì)胞類型中（如貼壁/懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等），都有著優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率、低毒性（特別相對(duì)于形成脂質(zhì)體復(fù)合物的Lipofectamine®系列試劑）、高性能的表現(xiàn)；

• 適用于多種研究領(lǐng)域，包括但不限于干細(xì)胞研究、基因編輯CRISPR研究、RNAi基因干擾/沉默、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建、低毒性的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)等；

• 允許高效且穩(wěn)定的同時(shí)遞轉(zhuǎn)多種核酸/蛋白類型，包括但不限于質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分。

為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著如此高性能及廣泛適應(yīng)性呢？這歸因于Mirus強(qiáng)大且高效的遞轉(zhuǎn)平臺(tái)設(shè)計(jì)，可進(jìn)行多重、多功能組合的轉(zhuǎn)染試劑組分篩選并優(yōu)化。成立于1995年的Mirus，專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域多年（圖1），從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級(jí)別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®，都是基于該遞轉(zhuǎn)平臺(tái)進(jìn)行設(shè)計(jì)及開(kāi)發(fā)的。截至目前，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過(guò)1萬(wàn)篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了超過(guò)1200種細(xì)胞類型，更多文章及數(shù)據(jù)查詢，請(qǐng)點(diǎn)擊這里。

圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒

不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑（如陽(yáng)離子聚合物或陽(yáng)離子脂質(zhì)體），為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，以應(yīng)對(duì)不同細(xì)胞類型或特定的應(yīng)用。Mirus將多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進(jìn)行多重組合，在不形成脂質(zhì)體復(fù)合物（即liposome，通常具有細(xì)胞毒性）前提條件下，得到多種類、高性能的轉(zhuǎn)染方案，克服細(xì)胞遞轉(zhuǎn)過(guò)程中的多重阻礙，以實(shí)現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低的細(xì)胞毒性（圖2）。

圖2 Mirus轉(zhuǎn)染試劑原理示意圖

基于上述Mirus強(qiáng)大、高效的遞轉(zhuǎn)平臺(tái)設(shè)計(jì)，在進(jìn)行多重、多組合篩選、優(yōu)化及后續(xù)驗(yàn)證，智能迭代設(shè)計(jì)流程，優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)中的每個(gè)組分（圖3）。Mirus推出一系列經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑，以應(yīng)對(duì)多種需求：

1. 廣譜、高性能、低毒性的轉(zhuǎn)染試劑家族: TransIT-X2®、TransIT®-LT1、TransIT®-2020

2. 針對(duì)特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染試劑家族：TransIT®-293、TransIT®-BrCa、TransIT®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER®、TransIT®-Insect、TransIT®-Jurkat、TransIT®-Keratinocyte

3. 針對(duì)特定應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑家族：

-      病毒生產(chǎn)：VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑及配套試劑盒、TransIT®-Lenti

-      蛋白/抗體生產(chǎn)：TransIT-PRO®、CHOgro® Expression System、CHOgro® High Yield Expression System

4. 寡核苷酸遞轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染家族：TransIT®-Oligo、TransIT-siQUEST®、TransIT-TKO®

5. mRNA及長(zhǎng)鏈RNA遞轉(zhuǎn)：TransIT®-mRNA

圖3 Mirus智能迭代設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化流程示意圖

Mirus TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑性能數(shù)據(jù)展示

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉(zhuǎn)表達(dá)EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)使用96孔板， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4µl，DNA加入量為0.1µg(使用試劑:DNA=2:1、3:1或4:1)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用Guava® easyCyte™ 5HT流式細(xì)胞儀重復(fù)檢測(cè)三次，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

圖4 TransIT-X2®在包括原代細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型中都具有較高轉(zhuǎn)染效率

使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)，通過(guò)熒光素酶活性評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，定量受損細(xì)胞中釋放的LDH評(píng)估細(xì)胞毒性。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細(xì)胞相比，在最佳試劑:DNA比例下，Trans - x2®有著更高的熒光強(qiáng)度及更低的細(xì)胞毒性。

圖5 相較于使用單一組分且形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑，TransIT-X2®有著更高的轉(zhuǎn)染效率及更低細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)Tips: 針對(duì)更多特定細(xì)胞類型，試劑使用建議，詳細(xì)請(qǐng)見(jiàn)：Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).

Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中性能數(shù)據(jù)展示

基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用，化學(xué)轉(zhuǎn)染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。常見(jiàn)參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

-      小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp)；

-      微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類短的、單鏈 RNA(20-22nt)。

利用 RNAi 抑制基因表達(dá)的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA)，這些短 RNA 序列可通過(guò)病毒或非病毒載體方式進(jìn)行表達(dá)，更多詳細(xì)信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。

圖6  不同RNAi干擾途徑示意圖

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染siRNA(靶點(diǎn)為內(nèi)源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1)，對(duì)照使用正常人類真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)遞轉(zhuǎn)非靶向siRNA。Trans IT-X2®加入量為4µl， Lipofectamine®2000加入量為6µl，siRNA加入量都為25 nM。使用qRT-PCR相對(duì)于18s rRNA水平測(cè)量GAPDH或AHA1 mRNA進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)均一化至非靶向?qū)φ战M的mRNA水平，誤差則為三次復(fù)孔實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖7  基于siRNA核酸遞轉(zhuǎn)類型的基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗(yàn)證，可降低PTK9 mRNA表達(dá)水平)。Pre-miR™陰性質(zhì)控用于評(píng)估mRNA表達(dá)水平基線值。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3µl， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對(duì)于18s rRNA水平，經(jīng)過(guò)陰性質(zhì)控的均一化，得到PTK9 mRNA表達(dá)水平值。

圖8  基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)中性能數(shù)據(jù)展示

經(jīng)過(guò)改造及優(yōu)化的細(xì)菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，已被廣泛應(yīng)用到哺乳細(xì)胞的基因編輯中?；?/span>CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)兩組分：Cas9蛋白及引導(dǎo)RNA(gRNA)。當(dāng)Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA，會(huì)觸發(fā)兩種內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(fù)(HDR)，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞中產(chǎn)生的DNA斷裂?；?/span>NHEJ細(xì)胞修復(fù)通路，為非精準(zhǔn)、且容易出錯(cuò)細(xì)胞修復(fù)通路，可引入導(dǎo)致基因功能缺失的Indel?；?/span>HDR的細(xì)胞修復(fù)通路，則需要額外的同源 DNA 作為修復(fù)模板，從而實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)”修復(fù)，在目的基因插入特定的基因或長(zhǎng)片段序列。

根據(jù)研究者們不同的實(shí)驗(yàn)需求，CRISPR基因編輯可以有多種類型實(shí)驗(yàn)設(shè)置，這意味需要面對(duì)不同核酸類型的轉(zhuǎn)染甚至共轉(zhuǎn)染，舉例如下：

1.      質(zhì)粒pDNA轉(zhuǎn)染

作為CRIPSR實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA，可以設(shè)計(jì)單個(gè)質(zhì)粒DNA，共同表達(dá)兩組分(A)；或者使用兩質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Cas9蛋白，另外一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)gRNA(B)；當(dāng)使用Cas9切口酶(Nickase)，則需要兩條gRNA，這時(shí)可能需要三質(zhì)粒系統(tǒng)的遞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。

2.      質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

此時(shí)，與上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的是，gRNA以寡核苷酸形式進(jìn)行遞轉(zhuǎn)，這就意味著遞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B)。

3.      mRNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)，可以共轉(zhuǎn)染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。

4.      Cas9/gRNA RNP復(fù)合物遞轉(zhuǎn)

隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟，越來(lái)越多的研究者們選擇直接從第三方購(gòu)買(mǎi)高保真Cas9蛋白，以及有著額外化學(xué)修飾且在細(xì)胞內(nèi)更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸。除了極大的縮短和簡(jiǎn)化CRISPR實(shí)驗(yàn)流程外，相對(duì)于質(zhì)粒或者mRNA方式合成，直接遞轉(zhuǎn)RNP復(fù)合物的方式有著更高的特異性及編輯效率。

實(shí)驗(yàn)Tips: 針對(duì)上述不同CRISPR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及遞轉(zhuǎn)情形，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明， 下載鏈接如下：

TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔，24孔板, Mirus Bio)共轉(zhuǎn)染0.5 µg質(zhì)粒DNA(表達(dá)Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，T7E1驗(yàn)證切割效率。

圖9 質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染：TransIT-X2®分別在293T/17、U2OS和NHDF細(xì)胞中共轉(zhuǎn)Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸)，都有著較高的基因編輯效率(18-48%)

2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復(fù)合體，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 µl/孔， Mirus Bio)、Lipofectamine® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔， ThermoFisher) 、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 遞轉(zhuǎn)至293T/17及U2OS細(xì)胞中。測(cè)試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM)，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，T7E1驗(yàn)證切割效率。

圖10 Cas9/gRNA RNP復(fù)合體遞轉(zhuǎn)：相較于Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑，TransIT-X2®有著更高的切割效率

Mirus TransIT-X2®產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

?新型基于多組分開(kāi)發(fā)的廣譜型轉(zhuǎn)染試劑(適用于多種細(xì)胞，包括難轉(zhuǎn)細(xì)胞)；

? 可同時(shí)轉(zhuǎn)染核酸及蛋白，包括不限于DNA，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復(fù)合物；

?不形成脂質(zhì)體復(fù)合物，降低細(xì)胞毒性；

? 滿足多種應(yīng)用：基因過(guò)表達(dá)、基因沉默、基因編輯、干細(xì)胞研究、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等。

相關(guān)產(chǎn)品信息

文末福利：

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美國(guó)Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開(kāi)發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司，同時(shí)也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一。Mirus其許多杰出成果獲得廣大用戶的好評(píng)。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國(guó)區(qū)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。